복부 병아리 중뇌에있는 마이크로 RNA의 오보, 식

요약

이소성 표현은 두뇌 발달의 마이크로 RNA의 역할을 명료하게 한 기술이다. 그러나, 비켜 일렉트로에 사용하여 특정 영역을 대상으로하는 것은 도전이다. 여기, 우리는 효율적으로 선택적으로 electroporate 복부와 등쪽 중뇌 영역에 표시됩니다.

초록

비 코딩 RNA를 유전자 발현을 조절하는데 추가 플레이어. 특정 지역의 OVO 일렉트로의 대상은 자궁외 마이크로 RNA 발현의 공간 및 시간 제어를위한 독특한 도구를 제공합니다. 그러나, 복부 중뇌와 같은 복부 뇌 구조는 모든 조작에 도달 오히려 어렵습니다. 여기, 우리는 얇은 백금 전극을 사용하여 복부 중뇌에 miRNA의를 electroporate하는 효율적인 방법을 보여줍니다. 이 방법은 중뇌 및 생체 연구를위한 유용한 도구의 특정 영역을 감염 될 수있는 신뢰할 수있는 방법을 제공합니다.

서론

유전자 발현에 대한 추가 플레이어와 같은 작은 비 코딩 RNA를 인식 게놈 프로그래밍 / 유전자 조절에 새로운 복잡성을 시작했다. 비 코딩 RNA를 다른 종은 작은 비 코딩 RNA를 ^1-4 포함하는 신경 세포의 기능적인 중요성이있다. 예를 들어, 마이크로 RNA (miRNA의 미르 나)는 두뇌 개발 ⁵ 별개의 변화 발현 프로파일을 보여줍니다. 개발하는 동안 유전자 발현과 침묵의 시간 및 공간 제어를위한 유일한 기회는 병아리 태아의 비켜 일렉트로에 제공 대상.

이 동영상은 일렉트로 ^6-10 OVO에서 사용하는 병아리 중뇌의 특정 영역에 미르의 이소성 표현을 수행하는 여러 단계를 보여줍니다. 세포에있는이 작은 비 코딩 RNA를의 긴 지속 효과를 보장하기 위해, 미르의 DNA 시퀀스는 모노 - 또는 바이 cistronic 벡터에 클로닝 하였다. 비켜 일렉트로의 경우, 미르는 V를 포함엑터는 달걀 껍질에 작은 창을 한 후 배아를 노출하여 중뇌의 신경 튜브에 주입된다. 중뇌 작은 플러스 (양극)과 음극 (캐소드)의 특정 영역을 형질 백금 전극을 특정 위치에 배치됩니다. 복측 중뇌 형질 들어, 애​​노드는 좌 복부 중뇌 및 전류를인가하기 전에 ....

프로토콜

1. 에서 비켜 Electroporation에 대한 요구 사항

1. 벡터 구조를 준비 : 미르의 센스와 안티센스 프라이머, Ambion의 지시 후 설계 소둔 및 ApaI로 결찰 / 효소 EcoRI는이 실험에서 pSilencer ™의 U6.1 벡터를 소화. 성공적으로 변환 후 생성 된 클론 중 하나가 성장하고,이 실험에서 pSilencer ™ 플라스미드 Quiagen 미디 준비 키트를 사용하여 알칼리 용해 방법으로 분리 하였다.
2. 전극 : 전극을 구입하실 수 있습니다 또는 쉽게 ^13를 만들 수. 우리는 백금 와이어의 자체 제작 전극 (Φ = 직경 0.2, 0.25, 0.5 mm)를 사용하거나 경우에 따라 더 작은 텅스텐 와이어 전극 (Φ = 0.1 mm) ^{8 우리가} electroporate하려는 지역에 따라 다릅니다. 조직의 뜨거운을 방지하기 위해, 우리는 조직 전극 얇은에 가까운 값으로 사용하십시오. 중뇌의 넓은 일렉트로 위해, 우리는 황동 / 스테인레스 스틸 관에 납땜 0.5 mm 백금 와이어를 사용샤프트 3-5 ㎜의 거리 (도 1)와 전극 홀더에 고정된다. 특정 영역을 electroporate하기 위해, 우리는 ....

결과

미르로 형질 중뇌 영역의 범위는 미르 발현 벡터 (그림 2)와 함께 주입 기자 벡터에서 GFP의 표현을 통해 볼 수 있습니다. 0.5 mm의 직경을 갖는 백금 전극을 사용하고 중뇌 후뇌, 때때로 간뇌 (도 2A와 B)를 포함하여 DV-및 AP-축을 따라 넓은 영역의 형질 전환에 일반적 중뇌 리드 AP 축에 평행하게 배치. 넓은 전계의 전극 결과의 크기는 뇌 영역 따라서 형질 넓은 영역에 적용.

정확하게, 예를 들어 복부 중뇌와 같은 영역을 대상으로하는 것이 곤란하다. 작은 전기장을 달성하기 위해 0.5 mm의 전극 간 거리를 감소시키는 것은 종종 배아 독성이며 인공물에 이르게한다. 우리는 더 많은 지역화 육 차원 속의를 제공하는 작은 직경 (0.2 ㎜, 0.25 ㎜의 백금 또는 0.1 mm 날카롭게 텅스텐 와이어)로 전극을 사용(그림 2C-I)에 도달하기 어려운 복부 뇌의 같은 nsfe.......

토론

이 비디오는 병아리 중뇌의 특정 영역의 neuroepithelial 세포에 플라스미드를 형질 할 수있는 효과적인 방법을 보여줍니다. 낮은 전압의 직사각형 전기 펄스는 ^6,16을 OVO에 병아리 신경 튜브의 세포에 DNA를 도입 할 수 있습니다. 그러나, DNA의 타겟팅 정확성은 종종 비교적 큰 전극 (Φ = 0.5 mm)을 통해 상승 넓은 전기장에 의해 방해된다. 우리는 모모 세 등. ^8의 지침에 따라 직경이 작은 전극을 사용하여이 문제를 해결하기 위해 노력했다. 배아의 나이는 직접 복부 중뇌 아래 허용하는 경우 복부 중뇌 형질 전환을 위해, 우리는 지역 pellucida 또는 막에서 음극을 배치합니다. 신경 / 중뇌 관 조직이 양극 감동을 손상하지 말아야하기 때문에 마지막 시나리오는 약간의 연습이 필요합니다. 벨소리를 추가하는 것은 종종 약간 지역 pellucida를 덮고있는 막 떨어져 태아의 머리를 들어 올리는 데 도움이 될 수 있습니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
Borosillicate 유리 모세관	Hartenstein		모델: 0.9mm
마이크로모세관 풀러	WPI, 베를린		모델: Pul1-E
Electroporator	Intracel		모델: TSSIC
실체현미경 - 형광	LEICA		모델: MZFLIII
실체현미경	Zeiss		모델: Stemi
카메라 및 소프트웨어	Zeiss		모델: Axiocam MRc/ Axiovision Re. 4.8