우리는 이미지 절단하여 형광 현미경 방법, 공동 병진 인증 (CoTrAC), 단백질의 기능을 perturbing없이 단일 분자 정밀도 라이브 세포의 단백질 분자의 생산을 설명합니다. 이 메소드는 전사 인자, λ 억제 CI의 확률 표현 역학을 수행하는 데 사용되었습니다 1.
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이 논문에서
요약
초록
우리는 이미지 절단하여 형광 현미경 방법, 공동 병진 인증 (CoTrAC) 단백질의 기능을 perturbing없이 단일 분자 정밀도 라이브 세포의 단백질 분자의 생산을 설명합니다. 이 방법은 가능한 연속 다섯 분 시간 창 동안 한 셀에서 생산되는 단백질 분자의 숫자를 계산 할 수 있습니다. 이 라이브 셀에 하나의 형광 단백질 분자를 감지 할 충분히 문자를 구분합니다 ~ 0.5-1 kW 급 / cm 2,의 레이저 여기 전력 밀도와 형광 현미경이 필요합니다. 막 타겟팅 순서, 빠른 속도로 성장하고, 노란색 형광 단백질과 단백 분해 효소 인식 순서 :이 방법에 사용되는 형광 기자는 세 부분으로 구성되어 있습니다. 기자는 translationally 관심 단백질의 N-말단에 융합되어 있습니다. 셀은 온도 조절 현미경 무대에서 성장하고 있습니다. 5 분마다, 세포 내 형광 분자 (이상 공동 이미징 아르) 형광 이미지를 분석하여 unted 만 새로 번역 된 단백질이 다음 측정에 포함됩니다 있도록 이후 photobleached.
이 방법에 의한 형광 이미지는 각 이미지의 형광 명소를 감지 개별 셀에 지정하고 세포 lineages에 셀을 지정하여 분석 할 수 있습니다. 주어진 셀에 시간 창 내에서 생산되는 단백질의 수는 단일 형광 분자의 평균 강도에 의해 장소의 통합 형광 강도를 나누어 계산됩니다. 우리는 하나의 5 분 시간 창에서 0-45 분자의 범위에서 표현 수준을 측정 할 수이 방법을 사용했습니다. 이 방법은 우리가 λ 억제 CI의 표현에 소음을 측정 할 수있게하고, 시스템 생물학에 많은 잠재적 인 응용 프로그램이 있습니다.
프로토콜
1. 스트레인 엔지니어링 워크 플로우
- 시퀀스 인코딩 (A) 막 현지화 순서, (b)는 빠른 속도로 성장하고 형광 단백질과와 관심 단백질 (예를 들어 전사 인자)와 프레임 (C) 단백 분해 효소 인식 서열 N-터미널.를 삽입 우리는 TSR-비너스 기자 대상 멤브레인을 사용하고 표현 박테리오파지 λ 억제 CI 단백질 분자의 수를 계산하기 위해 Ubiquitin 단백 분해 효소 인식 서열 (UB)에 융합. 우리가 지역을 코딩 CI 야생 형을 대체하고 E.에 구조를 통합, 융합 단백질 TSR-비너스-UB-CI를 구축 방법에 대한 자세한 내용은 λ 레드 재조합 3을 사용 대장균의 염색체가, 심판에 자세히 설명되어 있습니다. 1.
- 시퀀싱하여 모든 수정 사항을 확인합니다.
- 플라스미드 인코딩 할 관심의 형광 기자와 단백질을 표현 변종에 위의 사용 된 인식 순서에 맞는 프로테아제를 변환병진 융합 인치 우리는 C-터미널 Ubiquitin 잔류 네 직후 cleaves 단백 분해 효소 Ubp1을 사용 하였다.
2. 문화 셀 및 샘플 준비
- 한 E. 선택 갓 줄무늬 한천 플레이트에서 관심 대장균 식민지 하나 ML M9 최소한의 미디어 5로는 1X 가상 아미노산과 적절한 항생제로 보충. 원하는 온도로 흔드는에 품다는 충분히 달성 할 수 OD 600> 1.0 (600 nm의에서 광학 밀도).에게
- OD 600 = 0.02에 해당 항생제로 1 ML 신선한 M9 매체에 문화를 희석. 적절한 온도에서 흔드는에 품다. 저온 성장에 필요한 경우 초기 세포 밀도 증가 될 수있다.
- OD 600 = 0.2-0.3 (37에서 OD 600에서 초기 세포 배양과 ° C = 0.02, 이건 3-4 시간을 소요됩니다), 아가로 오스 겔 패드를 (3 단계) 준비를 시작합니다.
- 때 OD 셀 이미징을위한 준비 을 600 = 0.3-0.4.
- 1.5 ML의 microcentrifuge 튜브, benchtop microcentrifuge에서 1 분 10,000 XG에서 원심 분리기로 한 ML incubated 문화를 전송합니다.
- 표면에 뜨는을 취소하고 1 ML 신선한 M9 매체를 추가하고 펠렛을 부드럽게 resuspend.
- 1 분에 10,000 XG에 원심 분리기.
- 1.6 1.7 단계를 반복합니다. 표면에 뜨는 폐기하십시오.
- 부드럽게 한 ML M9 미디어에 resuspend. timelapse 영상에 대한 낮은 세포 밀도를 보장하기 위해 100 배에 - 세포를 직접 현미경 이미징 또는 희석 10 사용할 수 있습니다. 낮은 세포 밀도가 확장 timelapse 영상을 위해 중요합니다. 이미징 챔버 (4 단계)은 실험이 진행되는 동안 봉인되어 있습니다. 세포의 기하 급수적 인 성장으로 인해, 높은 초기 세포 농도는 크게 형광 단백질 성숙을 줄이고 세포의 성장에 영향을 미치는, 젤 패드의 장기 성장 후 챔버 내에 산소를 고갈 할 수 있습니다.
3. 아가로 오스 솔루션을 준비
- 10-20 MG를 달다1.5 ML의 microcentrifuge 관에 낮은 녹는 온도 아가로 오스.
- 3 % 아가로 오스 솔루션을 만들기 위해 항생제없이 적절한 볼륨 M9 최소한의 매체를 추가 할 수 있습니다.
- 70시 30 분의 아가로 오스 솔루션을 가열 ° C, 솔루션은 완전히 녹아 균일 성을 확보하기 위해 반전 튜브를 용해 할 수 있습니다. 젤 패드는이 점 (4 단계)에서 부어 할 수 있습니다 또는 온도는 ° C 50 감소하고 나중에 사용하기 위해 몇 시간 동안 실시 할 수 있습니다.
4. 상공 회의소에 젤 패드를 준비합니다
- 이미징 전에 약 50 분, 물과 Microaqueduct 슬라이드를 씻어.
- 하나는 커버 유리를 청소 (6에 설명 등 여러 엄격한 청소 방법을 사용하여)와 압축 공기로 불어하여 멸균 물과 건조로 슬라이드를 Microaqueduct 씻어.
- 이렇게이의 응용 프로그램을 수정할 수 있습니다 Microaqueduct 슬라이드 (의 유리면에 유입구 및 유출구를 포함하도록 Microaqueduct 슬라이드에 고무 개스킷을 삽입합니다어떤 미디어)은 샘플을 통해 perfused 있습니다. Microaqueduct 슬라이드의 중심 50 μl 아가로 오스 솔루션 (3 단계)을 적용합니다.
- 청소, 드라이 커버 유리와 아가로 오스 솔루션을 맨.
- 아가로 오스 솔루션은 30 분 동안 실온에서 서 보자.
- 한편, (제 2 단계) 세포 샘플을 준비합니다.
- 조심스럽게 젤 패드의 상단에서 덮개 유리에서 껍질. 젤 패드의 상단에 1.0 μl 한물 세포 배양을 추가합니다. 젤 패드에 의해 흡수 될 수있는 문화 ~ 2 분 기다리십시오. 그건 너무 오래 기다리지 않고 중요하다 젤 패드 overdries하지만, 충분히 전지가 올바르게 젤 패드을 준수되었는지 확인합니다.주세요 이상적인 대기 시간은 온도와 습도에 따라 달라질 수 있습니다.
- 기다리는 동안 다른 precleaned 커버 유리를 건조.
- 커버 유리와 Microaqueduct 슬라이드가 잘 정렬되어 있도록 새로운 커버 유리로 샘플을 커버.
- 제조업체의 지침에 따라 온도 제어 성장 챔버를 조립.그것은 지금 현미경 (단계 5)에서 영상을 위해 사용될 수 있습니다.
5. 이미징 및 Timelapse 영화의 취득
- 제조업체의 지시 사항 (예 : 레이저 실험 전에 ~ 0.5 시간에 예열해야 할 수도 있습니다) 다음과 같은 레이저와 현미경을 사용합니다.
- 현미경의 무대 삽입에 조립 챔버를 잠급니다. 성장 챔버의 온도와 37 ° C 나 기타 원하는 성장 온도에서 목표 히터를 설정합니다.
- 실온 위 이미징 경우, 초점이나 젤 패드는 일반적으로 초기 온도 변화 후 ~ 15 분 동안 크게 표류합니다. 실제로, 관심 지역을 찾아 실험을 위해 필요에 따라 이미징 스크립트를 수정할 시간을 사용합니다.
- 현미경에서 세포를 찾아 미리 정의와 정렬 이미징 지역 내에서 중심 한 후 각 셀의 위치를 저장합니다. 하나 이상의 셀은 각 이미지 획득 시간 창에서 이미징 할 수 있습니다. m 이상 timelapse 영상에 대한모든 세대가 다른 식민지 성장하는 동안 이미징 지역을 입력하지 않도록 이미징 세포가 처음 백 회에 몇 μm하여 다른 세포로부터 분리되어 있는지 확인하십시오.
- 그래서 레이저 여기 강도를 조정은 6 노출 내의 거의 모든 형광 분자의 photobleach (그림 5).
- 자동 이미지 스크립트 / 잡지, 그림 3의 실험 워크 플로우에 설명 된 알고리즘을 사용하여 timelapse 데이터를 가져올을 사용합니다.
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결과
λ 억제 CI의 생산을 추적 CoTrAC 실험에서 전형적인 결과는 그림 4와 5에 표시됩니다. 이 실험에서, 12 콜로니는 5 분 간격으로 이미징했다. 때마다 시점에서, 식민지 먼저 autofocused되었고 이미징 영역 내에 중앙. 다음으로 중심 / 중심의 위치가 저장되었고 brightfield 이미지가 인수되었습니다. 무대는 다음 세포를 (위상 대비 또는 차등 간섭 대비 (DIC) 광학없이 bisecting 비행기에 brightfield 초점 평면에서 이동하려면 Z-축을 따라 ~ 0.5 μm에 의해 translocated되었습니다 반투명 개체는 약간의 이미징 할 수 있습니다 밖에서 초점 비행기 8). 마지막으로, 여섯, 이미지는 100 밀리 초 노출 (그림 5는 하나의 시점을 보여줍니다)을 1 초 간격, 각에 인수되었다. 이것은 각각의 시점에서 모든 셀에 대해 반복되었다. 거의 모든 비너스 분자는 각 timepoint, fluores에서 pho...
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토론
CoTrAC 방법은 기존 N 또는 C-터미널 형광 단백질 fusions 단백질의 활동을 방해하는 다른 단백질의 생산을 측정하는 일반화 할 수 있습니다. CoTrAC 전략은 현재의 방법으로 세 독특한 장점이 있습니다. 첫째, 공동 병진 융합 형광 기자 분자가 실시간으로 단백질 생산의 정확한 계산을 허용, 관심있는 단백질의 각 분자에 대한 생산 될 수 있도록합니다. 둘째, 막 타겟 기자는 TSR-금성은 매우 낮은 수준에서 표현 단백질의 검출을 사용, 형광 기자의 단일 분자 검출 할 수 있습니다. 가장 중요한 세 번째와 네, 형광 기자의 공동 병진 절단 관심의 단백질은 E.의 단백 분해 효소 인식 순서로 Ubiquitin 일반적으로 - 사용하여 가까운 야생 형 시퀀스와 기능을 유지 할 수 있습니다 대장균은 대상 단백질은 그 첫 번째 N-터미널 N에서 자신의 야생 형 펩타이드 시퀀스 다를 </ EM> - 포르 밀 메티오닌 - 메티오닌은으로 변경됩니다.
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공개 사항
우리는 공개가 없습니다.
감사의 글
Ubp1을 표현 플라스미드 pCG001께서는 의학 연구의 존 커틴 대학에서 로한은 베이커에 의해 제공되었다. 이 작품은 천 연구 기금 1 FY2011 년 3 월, 천 바질 오코너 초보자 학술 연구 상 # 5 - FY20 및 NSF 경력 상 0,746,796 3 월에 자금을 지원했다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 시약의 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 코멘트 (선택 사항) |
| 아가로 오스 (낮은 녹는 온도) | Lonza | 50,100 | |
| 밀리 Q H 2 O | |||
| 5 × M9 소금 | 다음 제조법은 9에 설명 | ||
| 20 % 포도당 | |||
| MgSO 4 | |||
| CaCl 2 | |||
| 50 × 가상 아미노산 솔루션 | Invitrogen | 11130-051 | |
| 온도 조절 성장방 무대 어댑터 | Bioptechs | FCS-2 | |
| 목표 히터 | Bioptechs | 모델 현미경 대물에 따라 달라집니다 | |
| 슬라이드 Microaqueduct | Bioptechs | 130119-5 | |
| 마이크로 커버 유리 | VWR | 40CIR-1 | 소스에 어려울 수 있습니다, Bioptechs의 이용도 가능합니다 |
| 유리 / 슬라이드 근육 커버 | Bioptechs | FCS2 0.75 mm | |
| 형광 현미경 | 여러 | 예를 들어 설정 : 코 히어 런트 Innova 308C 아르곤 이온 레이저, 올림푸스 IX-81 현미경, 올림푸스 PlanApo 100X NA 1.45 목적, Metamorph 소프트웨어 | 레이저 여기, 자동화 XYZ 단계, 스크립트 이미징 및 자동 초점이 가능 자동화 소프트웨어 resolvin 할 수있는 광학이 있어야합니다g 단일 형광 단백질 |
| EM-CCD 카메라 | 여러 | 예를 들어 설정 : ANDOR Ixon DU-898 | 배경 위의 하나의 형광 단백질을 감지 충분히 낮은 소음을 가지고 있어야 |
참고문헌
- Hensel, Z., Feng, H. D., Han, B., Hatem, C., Wang, J., Xiao, J. Stochastic expression dynamics of transcription factor revealed by single-molecule noise analysis. Nat. Struct. Mol. Biol. 19, 797-802 (2012).
- Yu, J., Xiao, J., Ren, X., Lao, K., Xie, X. S. Probing Gene Expression in Live Cells, One Protein Molecule at a Time. Science. 311, 1600-1603 (2006).
- Datsenko, K. A., Wanner, B. L. One-step inactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K-12 using PCR products. Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A. 97, 6640-6645 (2000).
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- Sambrook, J., Russell, D. W. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. , ed. 3, Cold Spring Harbor Laboratory Press. New York. A2.2(2001).
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- Nagai, T., et al. A variant of yellow fluorescent protein with fast and efficient maturation for cell-biological applications. Nat. Biotechnol. 20, 87-90 (2002).
- Stagaman, G., Forsyth, J. Bright-field microscopy of semitransparent objects. J. Opt. Soc. Am. A. 5, 648-659 (1988).
- Tobias, J. W., Shrader, T. E., Rocap, G., Varshavsky, A. The N-end rule in bacteria. Science. 254, 1374-137 (1991).
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