유전자 규정의 단일 분자 이미징 생체에 절단하여 Cotranslational 인증 (CoTrAC)를 사용

요약

우리는 이미지 절단하여 형광 현미경 방법, 공동 병진 인증 (CoTrAC), 단백질의 기능을 perturbing없이 단일 분자 정밀도 라이브 세포의 단백질 분자의 생산을 설명합니다. 이 메소드는 전사 인자, λ 억제 CI의 확률 표현 역학을 수행하는 데 사용되었습니다 ¹.

초록

우리는 이미지 절단하여 형광 현미경 방법, 공동 병진 인증 (CoTrAC) 단백질의 기능을 perturbing없이 단일 분자 정밀도 라이브 세포의 단백질 분자의 생산을 설명합니다. 이 방법은 가능한 연속 다섯 분 시간 창 동안 한 셀에서 생산되는 단백질 분자의 숫자를 계산 할 수 있습니다. 이 라이브 셀에 하나의 형광 단백질 분자를 감지 할 충분히 문자를 구분합니다 ~ 0.5-1 kW 급 / cm ^2,의 레이저 여기 전력 밀도와 형광 현미경이 필요합니다. 막 타겟팅 순서, 빠른 속도로 성장하고, 노란색 형광 단백질과 단백 분해 효소 인식 순서 :이 방법에 사용되는 형광 기자는 세 부분으로 구성되어 있습니다. 기자는 translationally 관심 단백질의 N-말단에 융합되어 있습니다. 셀은 온도 조절 현미경 무대에서 성장하고 있습니다. 5 분마다, 세포 내 형광 분자 (이상 공동 이미징 아르) 형광 이미지를 분석하여 unted 만 새로 번역 된 단백질이 다음 측정에 포함됩니다 있도록 이후 photobleached.

이 방법에 의한 형광 이미지는 각 이미지의 형광 명소를 감지 개별 셀에 지정하고 세포 lineages에 셀을 지정하여 분석 할 수 있습니다. 주어진 셀에 시간 창 내에서 생산되는 단백질의 수는 단일 형광 분자의 평균 강도에 의해 장소의 통합 형광 강도를 나누어 계산됩니다. 우리는 하나의 5 분 시간 창에서 0-45 분자의 범위에서 표현 수준을 측정 할 수이 방법을 사용했습니다. 이 방법은 우리가 λ 억제 CI의 표현에 소음을 측정 할 수있게하고, 시스템 생물학에 많은 잠재적 인 응용 프로그램이 있습니다.

프로토콜

1. 스트레인 엔지니어링 워크 플로우

1. 시퀀스 인코딩 (A) 막 현지화 순서, (b)는 빠른 속도로 성장하고 형광 단백질과와 관심 단백질 (예를 들어 전사 인자)와 프레임 (C) 단백 분해 효소 인식 서열 N-터미널.를 삽입 우리는 TSR-비너스 ^기자 대상 멤브레인을 사용하고 표현 박테리오파지 λ 억제 CI 단백질 분자의 수를 계산하기 위해 Ubiquitin 단백 분해 효소 인식 서열 (UB)에 융합. 우리가 지역을 코딩 CI 야생 형을 대체하고 E.에 구조를 통합, 융합 단백질 TSR-비너스-UB-CI를 구축 방법에 대한 자세한 내용은 λ 레드 재조합 ^3을 사용 대장균의 염색체가, 심판에 자세히 설명되어 있습니다. 1.
2. 시퀀싱하여 모든 수정 사항을 확인합니다.
3. 플라스미드 인코딩 할 관심의 형광 기자와 단백질을 표현 변종에 위의 사용 된 인식 순서에 맞는 프로테아제를 변환병진 융합 인치 우리는 C-터미널 Ubiquitin 잔류 ^네 직후 cleaves 단백 분해 효소 Ubp1을 사용 하였다.

2. 문화 셀 및 샘플 준비

1. 한 E. 선택 갓 줄무늬 한천 플레이트에서 관심 대장균 식민지 하나 ML M9 최소한의 미디어 ^5로는 1X 가상 아미노산과 적절한 항생제로 보충. 원하는 온도로 흔드는에 품다는 충분히 달성 할 수 OD _600> 1.0 (600 nm의에서 광학 밀도).에게
2. OD ₆₀₀ = 0.02에 해당 항생제로 1 ML 신선한 M9 매체에 문화를 희석. 적절한 온도에서 흔드는에 품다. 저온 성장에 필요한 경우 초기 세포 밀도 증가 될 수있다.
3. OD ₆₀₀ = 0.2-0.3 (37에서 OD _600에서 초기 세포 배양과 ° C = 0.02, 이건 3-4 시간을 소요됩니다), 아가로 오스 겔 패드를 (3 단계) 준비를 시작합니다.
4. 때 OD 셀 이미징을위한 준비 _{을 600 = 0.3-0.4.}
5. 1.5 ML의 microcentrifuge 튜브, benchtop microcentrifuge에서 1 분 10,000 XG에서 원심 분리기로 한 ML incubated 문화를 전송합니다.
6. 표면에 뜨는을 취소하고 1 ML 신선한 M9 매체를 추가하고 펠렛을 부드럽게 resuspend.
7. 1 분에 10,000 XG에 원심 분리기.
8. 1.6 1.7 단계를 반복합니다. 표면에 뜨는 폐기하십시오.
9. 부드럽게 한 ML M9 미디어에 resuspend. timelapse 영상에 대한 낮은 세포 밀도를 보장하기 위해 100 배에 - 세포를 직접 현미경 이미징 또는 희석 10 사용할 수 있습니다. 낮은 세포 밀도가 확장 timelapse 영상을 위해 중요합니다. 이미징 챔버 (4 단계)은 실험이 진행되는 동안 봉인되어 있습니다. 세포의 기하 급수적 인 성장으로 인해, 높은 초기 세포 농도는 크게 형광 단백질 성숙을 줄이고 세포의 성장에 영향을 미치는, 젤 패드의 장기 성장 후 챔버 내에 산소를 고갈 할 수 있습니다.

3. 아가로 오스 솔루션을 준비

1. 10-20 MG를 달다1.5 ML의 microcentrifuge 관에 낮은 녹는 온도 아가로 오스.
2. 3 % 아가로 오스 솔루션을 만들기 위해 항생제없이 적절한 볼륨 M9 최소한의 매체를 추가 할 수 있습니다.
3. 70시 30 분의 아가로 오스 솔루션을 가열 ° C, 솔루션은 완전히 녹아 균일 성을 확보하기 위해 반전 튜브를 용해 할 수 있습니다. 젤 패드는이 점 (4 단계)에서 부어 할 수 있습니다 또는 온도는 ° C 50 감소하고 나중에 사용하기 위해 몇 시간 동안 실시 할 수 있습니다.

4. 상공 회의소에 젤 패드를 준비합니다

1. 이미징 전에 약 50 분, 물과 Microaqueduct 슬라이드를 씻어.
2. 하나는 커버 유리를 청소 ^(6에 설명 등 여러 엄격한 청소 방법을 사용하여)와 압축 공기로 불어하여 멸균 물과 건조로 슬라이드를 Microaqueduct 씻어.
3. 이렇게이의 응용 프로그램을 수정할 수 있습니다 Microaqueduct 슬라이드 (의 유리면에 유입구 및 유출구를 포함하도록 Microaqueduct 슬라이드에 고무 개스킷을 삽입합니다어떤 미디어)은 샘플을 통해 perfused 있습니다. Microaqueduct 슬라이드의 중심 50 μl 아가로 오스 솔루션 (3 단계)을 적용합니다.
4. 청소, 드라이 커버 유리와 아가로 오스 솔루션을 맨.
5. 아가로 오스 솔루션은 30 분 동안 실온에서 서 보자.
6. 한편, (제 2 단계) 세포 샘플을 준비합니다.
7. 조심스럽게 젤 패드의 상단에서 덮개 유리에서 껍질. 젤 패드의 상단에 1.0 μl 한물 세포 배양을 추가합니다. 젤 패드에 의해 흡수 될 수있는 문화 ~ 2 분 기다리십시오. 그건 너무 오래 기다리지 않고 중요하다 젤 패드 overdries하지만, 충분히 전지가 올바르게 젤 패드을 준수되었는지 확인합니다.주세요 이상적인 대기 시간은 온도와 습도에 따라 달라질 수 있습니다.
8. 기다리는 동안 다른 precleaned 커버 유리를 건조.
9. 커버 유리와 Microaqueduct 슬라이드가 잘 정렬되어 있도록 새로운 커버 유리로 샘플을 커버.
10. 제조업체의 지침에 따라 온도 제어 성장 챔버를 조립.그것은 지금 현미경 (단계 5)에서 영상을 위해 사용될 수 있습니다.

5. 이미징 및 Timelapse 영화의 취득

1. 제조업체의 지시 사항 (예 : 레이저 실험 전에 ~ 0.5 시간에 예열해야 할 수도 있습니다) 다음과 같은 레이저와 현미경을 사용합니다.
2. 현미경의 무대 삽입에 조립 챔버를 잠급니다. 성장 챔버의 온도와 37 ° C 나 기타 원하는 성장 온도에서 목표 히터를 설정합니다.
3. 실온 위 이미징 경우, 초점이나 젤 패드는 일반적으로 초기 온도 변화 후 ~ 15 분 동안 크게 표류합니다. 실제로, 관심 지역을 찾아 실험을 위해 필요에 따라 이미징 스크립트를 수정할 시간을 사용합니다.
4. 현미경에서 세포를 찾아 미리 정의와 정렬 이미징 지역 내에서 중심 한 후 각 셀의 위치를​​ 저장합니다. 하나 이상의 셀은 각 이미지 획득 시간 창에서 이미징 할 수 있습니다. m 이상 timelapse 영상에 대한모든 세대가 다른 식민지 성장하는 동안 이미징 지역을 입력하지 않도록 이미징 세포가 처음 백 회에 몇 μm하여 다른 세포로부터 분리되어 있는지 확인하십시오.
5. 그래서 레이저 여기 강도를 조정은 6 노출 내의 거의 모든 형광 분자의 photobleach (그림 5).
6. 자동 이미지 스크립트 / 잡지, 그림 3의 실험 워크 플로우에 설명 된 알고리즘을 사용하여 timelapse 데이터를 가져올을 사용합니다.

결과

λ 억제 CI의 생산을 추적 CoTrAC 실험에서 전형적인 결과는 그림 4와 5에 표시됩니다. 이 실험에서, 12 콜로니는 5 분 간격으로 이미징했다. 때마다 시점에서, 식민지 먼저 autofocused되었고 이미징 영역 내에 중앙. 다음으로 중심 / 중심의 위치가 저장되었고 brightfield 이미지가 인수되었습니다. 무대는 다음 세포를 (위상 대비 또는 차등 간섭 대비 (DIC) 광학없이 bisecting 비행기에 brightfield 초점 평면에서 이동하려면 Z-축을 따라 ~ 0.5 μm에 의해 translocated되었습니다 반투명 개체는 약간의 이미징 할 수 있습니다 밖에서 초점 비행기 ^8). 마지막으로, 여섯, 이미지는 100 밀리 초 노출 (그림 5는 하나의 시점을 보여줍니다)을 1 초 간격, 각에 인수되었다. 이것은 각각의 시점에서 모든 셀에 대해 반복되었다. 거의 모든 비너스 분자는 각 timepoint, fluores에서 pho...

토론

CoTrAC 방법은 기존 N 또는 C-터미널 형광 단백질 fusions 단백질의 활동을 방해하는 다른 단백질의 생산을 측정하는 일반화 할 수 있습니다. CoTrAC 전략은 현재의 방법으로 세 독특한 장점이 있습니다. 첫째, 공동 병진 융합 형광 기자 분자가 실시간으로 단백질 생산의 정확한 계산을 허용, 관심있는 단백질의 각 분자에 대한 생산 될 수 있도록합니다. 둘째, 막 타겟 기자는 TSR-금성은 매우 낮은 수준에서 표현 단백질의 검출을 사용, 형광 기자의 단일 분자 검출 할 수 있습니다. 가장 중요한 세 번째와 네, 형광 기자의 공동 병진 절단 관심의 단백질은 E.의 단백 분해 효소 인식 순서로 Ubiquitin 일반적으로 - 사용하여 가까운 야생 형 시퀀스와 기능을 유지 할 수 있습니다 대장균은 대상 단백질은 그 첫 번째 N-터미널 N에서 자신의 야생 형 펩타이드 시퀀스 다를 </ EM> - 포르 밀 메티오닌 - 메티오닌은으로 변경됩니다.

...

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
시약의 이름	회사	카탈로그 번호	코멘트 (선택 사항)
아가로 오스 (낮은 녹는 온도)	Lonza	50,100
밀리 Q H 2 O
5 × M9 소금			다음 제조법은 9에 설명
20 % 포도당
MgSO 4
CaCl 2
50 × 가상 아미노산 솔루션	Invitrogen	11130-051
온도 조절 성장방 무대 어댑터	Bioptechs	FCS-2
목표 히터	Bioptechs	모델 현미경 대물에 따라 달라집니다
슬라이드 Microaqueduct	Bioptechs	130119-5
마이크로 커버 유리	VWR	40CIR-1	소스에 어려울 수 있습니다, Bioptechs의 이용도 가능합니다
유리 / 슬라이드 근육 커버	Bioptechs	FCS2 0.75 mm
형광 현미경	여러	예를 들어 설정 : 코 히어 런트 Innova 308C 아르곤 이온 레이저, 올림푸스 IX-81 현미경, 올림푸스 PlanApo 100X NA 1.45 목적, Metamorph 소프트웨어	레이저 여기, 자동화 XYZ 단계, 스크립트 이미징 및 자동 초점이 가능 자동화 소프트웨어 resolvin 할 수있는 광학이 있어야합니다g 단일 형광 단백질
EM-CCD 카메라	여러	예를 들어 설정 : ANDOR Ixon DU-898	배경 위의 하나의 형광 단백질을 감지 충분히 낮은 소음을 가지고 있어야