혜성 분석은 알칼리 불안정한 사이트와 hippocampal 뉴런을 포함한 모든 세포의 DNA에 DNA-DNA/DNA-protein 상호 링크 등 단일 및 이중 가닥 휴식을 검출 효율적인 방법입니다. 방법은 DNA 손상의 양의 차이로 인해 전기 분야에서 DNA의 차동 마이그레이션을 활용합니다.
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이 논문에서
요약
초록
약물의 수는 DNA 복구 경로를 타겟으로하고 세포가 DNA 손상을 만들어 죽 유도. 따라서, 직접 DNA 손상을 측정하기위한 프로세스를 광범위하게 평가되었습니다. 전통적인 방법은 시간이 소요, 비용, 리소스를 집중하고 세포가 복제를 필요로합니다. 반면, 혜성 분석, 단일 세포 겔 전기 영동 분석은 DNA 손상 및 수리를 빠르고 비 침습적, 저렴한, 직접 민감한 측정하기위한 한 방법입니다. DNA 손상뿐만 아니라 DNA 수리의 모든 양식이 강력한 기술을 사용하여 단일 세포 수준에서 시각화 할 수 있습니다.
혜성 분석의 기초 원리는 DNA 손상이 조직을 방해 반면에 그대로 DNA가 높은 주문이다. 손상된 DNA의 아가로 오스 매트릭스에 새어 나온 및 전기 분야의 대상이 때, 부정적인 청구 DNA가 긍정적으로 청구됩니다 음극으로 마이그레이션합니다. 큰 피해 DNA의 가닥 훨씬 핵에서 마이그레이션 할 수 없습니다. DNA 손상더 손상 DNA보다 여행 작은 DNA 조각을 만듭니다. 혜성 분석, 이미지 분석 소프트웨어, 조치하고 핵에서 마이그레이션 DNA와 핵에서 DNA의 전체 형광 강도를 비교합니다. 마이그레이션 DNA의 형광 신호가 DNA 손상에 비례합니다. 긴 밝은 DNA 꼬리 증가 DNA 손상을 의미합니다. 측정 매개 변수 중 일부는 꼬리에있는 DNA의 금액과 꼬리, 꼬리 길이 DNA의 유통 및 DNA의 비율 모두의 척도입니다 꼬리 순간입니다. 이 분석은 DNA 손상의 해상도가 복구가 자리를 차지하게 때문에뿐만 아니라 DNA 복구를 측정 할 수 있습니다. 감도의 제한 diploid 포유류의 세포 1,2 당 약 50 스트랜드 나누기입니다. 같은 etoposide와 같은 DNA 손상 대리인과 치료 세포는 긍정적 인 컨트롤로 사용할 수 있습니다. 따라서 혜성 분석은 DNA 손상을 측정 할 수있는 신속하고 효과적인 절차입니다.
프로토콜
1. 세포 배양
- 문화 neuronal 세포와이를 필요에 따라 취급합니다.
- 15 ML 튜브에 수확 세포 : 기음 미디어, 인산염과 린스 (PBS, 칼슘, 마그네슘 무료) 생리 버퍼, 15 ML 튜브에 수집하고 적절한 혈청이 포함 된 미디어와 트립신을 중화, 트립신을 추가합니다.
- 5 분 1,000 XG에서 봐.
- 미디어를 대기음.
- PBS에 세포를 Resuspend.
- 5 분 1,000 XG에서 봐.
- 신선한 PBS에서 미디어 및 resuspend 세포를 대기음.
- hemacytometer이나 선호하는 셀 카운터를 사용하여 셀을 계산합니다.
- 세포 샘플은 분석을 시작하기 바로 전에 준비해야합니다.
- 모든 샘플은 자외선에서 DNA 손상을 방지하기 위해 어둡거나 노란 빛으로 처리해야합니다.
2. 혜성 분석
1. 슬라이드 준비
- 1% 아가로 오스를 (1X 트리스베이스, 붕산, EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산), TB의 1g / 100 ML 녹음E) 3 분의 전자 레인지의 모든 과립가 사라 때까지. <....
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토론
혜성 분석은 개별 세포를 분석의 고유 한 능력이 있습니다. 이 세포 독성 요원에게 차등 응답을 보여 세포의 subpopulations의 식별에 유리한 것입니다. 몇 실제적인 제한이 고려되어야한다. 개별적으로 평가 될 수있는 세포의 수는 개인에 따라 다를 수 있습니다. 인구 내에서 DNA 손상에 차이가있을 경우 표본의 크기가 증가해야합니다. 괴사 또는 apoptotic 세포의 주된 존재가 에러가 추가되므로 가능한 단일 셀 정지이 분석에 중요합니다. 용해와 전기 단계는 apoptotic 세포, 작은 DNA 조각 (50킬로바이트보다 작)과 mitochondrial DNA의 제거됩니다. 따라서, 그들은 혜성 분석 1,3-11에 의해 감지되지 않습니다.
위에서 언급 한 바와 같이, 혜성 분석은 알칼리 불안정한 사이트에 DNA-DNA/DNA-protein 상호 링크 등 단일 및 이중 가닥 휴식을 검출 효율적인 방법입니다DNA. 중립 혜성 분석은 두 번 스트랜드 나누기.......
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공개 사항
관심 없음 충돌이 선언 없습니다.
감사의 글
이 작품은 방사선 종양학, 앨라배마 - 버밍햄 대학 종합 암 센터, 파이팅 어린이 암 재단과 가브리엘의 엔젤 재단 (ESY 있습니다.)의 부에서 IMPACT 상에 의해 지원되었다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 시약의 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 코멘트 (선택 사항) |
| 1.5 ML 튜브 | 산타 크루즈 (Santa Cruz) 생명 공학, Inc의 | SC-200271 | |
| 10X TBE (트리스베이스, 붕소의 산성, EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산)) | 피셔 과학 | BP13331 | |
| 15 ML 튜브 | 피셔 과학 | 0553851 | |
| 아가로 오스 | 시그마 | A5093 | |
| 알루미늄 호일 | 피셔 과학 | 01213101 | |
| 굽 달린 큰 컵 | 피셔 과학 | FB102300 | |
| 원심 분리기 | 열 과학 | 75004261PR | |
| 혜성 분석 소프트웨어 | 혜성 분석 IV 이미지 분석 시스템 | ||
| 실린더 | 피셔 과학 | 08555F | |
| EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) | GIBCO | 15,575 | |
| 전기 챔버 | 열 과학 | 09528101 | |
| 에탄올 | 피셔 과학 | A407P4 | |
| 형광 현미경 | Zeiss Axio 비전 | 그린 필터 가진 형광 현미경은 충분 | |
| Hemacytometer | 피셔 과학 | 0267152 | |
| 낮은 녹는 점 아가로 오스 | Promega | V2111 | |
| 마이크로파 | 시어스 | ||
| 인산염은 무료 생리, 칼슘 무료, 마그네슘 버퍼 | HyClone | SH3025601 | |
| 전원 공급 장치 | BioRad | 1645050 | |
| 냉장고 | 시어스 | ||
| 지배자 | 스테이플 | ||
| 슬라이드 | 피셔 과학 | 12550143 | |
| 나트륨 염화물 | 시그마 | S7653 | |
| 수산화 나트륨 | 시그마 | S5881 | |
| 나트륨 라 우릴 sarcosinate | 피셔 과학 | S529 | |
| Sybr 녹색 | Invitrogen | S7585 | |
| 쟁반 | FIS그녀 과학 | 15242B | |
| 트리스베이스 | 시그마 | T6066 | |
| 트리톤 - X 100 | 시그마 | T8787 | |
| 트립신 | HyClone | SH3023601 | |
| 소용돌이 | 피셔 과학 | 02216108 | |
| 열탕 목욕 | 피셔 과학 | 154622Q |
참고문헌
- Olive, P. L., Banath, J. P. The comet assay: a method to measure DNA damage in individual cells. Nat. Protoc. 1, 23-29 (2006).
- Hovhannisyan, G. G. Fluorescence in situ hybridization in combination with the comet assay and micronucleu....
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