T 세포 양적 높은 처리량 단일 세포 세포 독성 분석

요약

우리는 종양 대상 세포와 incubated 때 T 세포의 세포 독성을 측정 할 수있는 단일 셀 높은 처리량 분석을 설명합니다. 이 방법은 spatially 정의 비율에서 T 세포와 대상 세포를 한정하는 하위 nanoliter 우물 (~ 100,000 우물 / 배열)의 조밀 한, 탄성 배열을 사용하고 이펙터 - 대상 활용 및 후속 apoptosis를 모니터링하는 형광 현미경에 연결된다.

초록

암 immunotherapy는 종양을 타겟팅하고 제거하는 면역 반응의 특이성을 활용 할 수 있습니다. 유전자 키메라 항원 수용체 (자동차)을 표현하도록 수정 T 세포의 입양 전송을 기반으로 입양 세포 치료 (ACT)는 임상 실험 ^1-4에서 상당한 약속을 보여 주었다. 이 자동차를 사용하여 ⁺ T 세포 비 MHC 제한 항원을 타겟팅하고 호스트에서 추적 및 지속성 최적의 생존을위한 T 세포를 functionalize 할 수있는 능력을 포함 암의 치료를 위해 다음과 같은 여러 장점이 있습니다, 그리고 마지막으로 자동차의 apoptosis를 유도하기 ⁺ 호스트 독성 ^(5)의 경우에 T 세포.

자동차의 최적의 기능을 Delineating ⁺ 임상 이익과 관련된 T 세포가 임상 시험의 다음 세대를 디자인하는 것이 필수적입니다. multiphoton 현미경 같은 라이브 동물 이미징의 최근 발전 면역 세포 기능의 연구를 혁신 한 전N 생체 ^6,7. 이 연구 생체, 임상 실험에서 T-세포 기반 ACT에서 T-세포 기능의 우리의 이해를 전진했지만에 활용하여, 사전에 주입 임상 효능 후 주입와 T-세포 준비의 분자 및 기능 기능을 연결 할 필요가 필요합니다 세포 독성 및 시토 킨 분비, 같은 T-세포 기능을 모니터링 체외 assays. 표준 흐름 세포 계측법 기반 assays은 단일 셀 수준의 T 세포 인구의 전반적인 기능을 결정하지만, 이러한 공액 형성과 수명 또는 여러 대상에게 ⁸ 죽일 같은 세포의 기능을 모니터링에 적합하지 않다고 개발되었습니다.

polydimethylsiloxane (PDMS) 등의 biocompatible 폴리머로 설계 Microfabricated 배열 spatially effectors 작은 볼륨 ⁹ 대상을 한정 할 수있는 특히 매력적인 방법입니다. 자동 시간 경과 형광 현미경, tho와 함께효과기 - 대상의 상호 작용 usands은 nanowell 배열의 이미징 개인 우물에서 동시에 모니터링 할 수 있습니다. 우리는 여기서 크게 T 세포의 cytolytic 기능을 공부에 적용 할 수있는 단일 셀 레벨에서 T-세포 매개의 세포 독성을 모니터링하기위한 높은 처리량 방법론을 제시한다.

프로토콜

1. 시약 준비

1. 500 ML RPMI-1640 5 ML을 혼합하여 RPMI-PLGH을 준비 페니실린 - 스트렙토 마이신, L-글루타민, 그리고 HEPES 솔루션의 각.
2. 10% 태아 소 혈청 (FBS)와 RPMI-PLGH을 혼합하여 R10 솔루션을 준비합니다. FBS는 또한 30 분에 대한 ° C 이전 56에서 열 inactivated입니다.
3. 37 번 프리 따뜻한 ° C RPMI-PLGH, 멸균 원추형 튜브의 R10 15 PBS의 ML, 15 ML 50 ML.
4. PDMS의 nanowells의 배열의 제조 : 실리콘 마스터는 석판 술 본질적으로 이전 ¹⁰ 설명을 사용하여 제조된다. 철저하게 플라스틱 칼을 사용하여 Sylgard 184 엘라스토머 키트베이스와 일회용 컵에 10시 1분 체중의 비율로 경화 에이전트를 섞는다. 1 시간의 진공 챔버에서 가스를 제거하다의 혼합물. , nanowell 배열에 혼합물을 부어 유리 슬라이드로 밀봉하고 30 분에 앉아 보자. ° C 2 시간 80로 설정 오븐에 어셈블리를 전송하고 1 시간 동안 실온에서 시원한 보자. 엘라스토머는 현재 것이다이 기간과 의지의 유리 슬라이드에 결합시 전자. PDMS nanowell 배열을 포함하는 유리 슬라이드는 신중하게 스카치 테이프로 덮....

결과

높은 처리량 cytolytic 분석의 응용의 예는 그림 2에 보여 있습니다. 간단히, CD19 별 CAR 표시 ⁺ T 세포는 nanowell 배열의 각 우물 (제 1-5)에 표시된 마우스 EL4 대상 세포와 공동 incubated되었습니다. 초기 이미지는 배열 (제 6 항)에 하나 하나 nanowell의 수용 인원을 (effectors 및 / 또는 타겟) 식별하기 위해 자동 형광 현미경에 기록되었습니다. 이미지 처리는 정확히 하나의 대상과 하나의 이펙터를 포함하는 모든 nanowells을 확인하고 죽은 대상 (제 9) 포함 nanowells를 제외하는 데 사용되었다. 이 칩은 6h에 대한 보육에 전송 된 후 칩의 두 번째 이미지는 (제 7-8) 기록되었다. 대상 셀의 apoptosis를 유도하는 이펙터의 기능은 정확히 하나의 이펙터 한 목표를 포함 nanowells에서 Annexin V와 얼룩에 의해 측정되었다. 두 개의 평행 한 실험은 같은 effectors와 두 세트의 O를.......

토론

우리는 nanowells의 배열 (그림 1) effectors 및 대상의 공동 배양을 통해 활성화 높은 처리량 단일 셀 cytolytic 분석을위한 프로토콜을 설명하고 있습니다. 처리량뿐만 아니라 기술의 주요 장점은 결과적으로 대상 셀과 autologous 또는 기본 / 검색 종양 세포의 사용을 허용 대상 세포 공학 필요없이 원하는 대상 세포에 대한 이펙터로 인한 세포 독성을 모니터링 할 수있는 기능입니다. 공간 제한은 검정 ⁹ 끝의 검색 및 기능 T 세포의 후속 복제 할 수 있습니다. 분석의 한계는 자동화 단계와 빠른 스위칭 광학있는 전문 현미경이 필요합니다. 이 그러나이 기계는 지금​​ 연구 핵심 시설의 일환으로 널리 사용할 수 있습니다 점을 감안할 때 심각한 제한이 없습니다.

높은 처리량을 제공합니다 흐름 세포 계측법 기반 assays의 다양한 방법이 있지만 preservi단일 셀 해상도 것이다. 이러한 effectors.......

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
시약 / 재료의 이름	회사	카탈로그 번호	코멘트
RPMI-1천6백40와트 / O L-글루타민	Cellgro	15-040 - CV
페니실린 - 스트렙토 마이신	Cellgro	30-002 - CI	10,000 IU 페니실린 10,000 μg / ML 스트렙토 마이신
L-글루타민	Cellgro	25-005 - CI	200 MM 솔루션
HEPES	시그마 알드리치	H3537	100
태아 소 혈청 (FBS)	애틀랜타 체액	S11150	롯 테스트
셀 추적기 레드 청바지	Invitrogen	C34552	50 μg
Vybrant DyeCycle이 있었던 청바지	Invitrogen	V35003	5 MM
SYTOX 녹색 핵산의 산 얼룩	Invitrogen	S7020	5 MM
Annexin V-알렉사 형석 647	Invitrogen	A23204	500 μl
Dulbecco의 PBS	Cellgro	21-031 - CV	500 ML
귀족 한천	DIFCO	2M220	100g
Trypan 블루	시그마 알드리치	T8154	0.4 % 액체, 무균 여과
Hemocytometer	Hausser Scientifics	1492	밝은 라인
4 잘 판	온도 피셔	167603
Harrick 플라즈마 클리너	Harrick 플라즈마	PDC-32G	기본 플라즈마 청소기
Observer.Z1	ZEISS		형광 현미경 (아래의 세 부분으로 작동)
람다 10-3	셔터 악기		필터 컨트롤러
람다 DG-4	셔터 악기		초 고속 파장 스위처
하마 마츠 EM-CCD 카메라	하마 마츠	C9100-13	CCD - 현미경 카메라
15 ML 원뿔 관	BD 팔콘	352097
50 ML 원뿔 관	VWR	3282-345-300
니콘 Biostation	니콘 인스트루먼트 주식회사	Biostation IM
유리 바닥 문화 요리	MatTek 공사	P35G-0	35mm 페트리 접시, 10mm microwell