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방법 논문

퇴행성 관상 재관류에 의한 돼지 심장의 Decellularization 절차

23.6K 조회수

⸱

DOI:

10.3791/50059

⸱

2012년 12월 6일

 ,  , 
1McGowan Institute for Regenerative Medicine, 2Department of Bioengineering, University of Pittsburgh, 3Department of Cardiothoracic Surgery, Children's Hospital of Pittsburgh of UPMC, 4Department of Surgery, University of Pittsburgh

이 논문에서

요약

신속하고 완벽하게 역행 재관류를 통해 그대로 돼지의 심장에서 세포 구성 요소를 제거하는 방법이 설명되어 있습니다. 이 방법은 여러 임상 응용 프로그램에서 사용하기 위해 가능성이있는 사이트 특정 심장 세포 외 기질 비계를 산출.

초록

크게 비계의 기본 구조를 유지하면서 재관류 기반 전체 오르간 decellularization은 최근, 특정 사이트 세포 외 기질 공사장 공중 발판을 만들 수있는 수단으로 조직 공학 분야에 대한 관심을 얻었습니다. 현재까지이 방식은 심장, 폐, 간 1-5을 포함한 장기 시스템의 다양한 활용되었습니다. 쉽게 접근 할 수 혈관 네트워크가없는 조직에 대한 이전 decellularization 방법은 세제, 산, 또는 주변 세포 환경 6-8에서 세포와 핵 구성 요소를 제거하는 수단으로 효소 트리트먼트 솔루션에 조직의 장시간 노출시 의존하고 있습니다. 그러나, 솔루션의 능력에 따라 이러한 방법 힌지의 효과는 확산을 통해 조직을 침투합니다. 대조적으로, 자연 혈관 시스템을 통해 기관의 재관류 효과적으로 확산 거리와 decellularizati의 촉진 수송을 감소조직에서 조직과 세포의 구성 요소에 에이전트 있습니다. 여기, 우리는 완전히 관상 동맥 재관류 역행을 통해 그대로 돼지의 심장을 decellularize하는 방법을 설명합니다. 프로토콜은 그대로 심장의 3 차원 구조를 완벽하게 decellularized 심장 세포 외 기질 (C-ECM) 비계를 굴복. 우리의 방법은 효소, 세제, 그리고 세포의 용해 및 제거에 도움 hypertonic과 hypotonic 린스와 커플 링 산 일련의를 사용했습니다. 프로토콜은 세포 물질의 제거에 도움 튼 X-100과 나트륨 deoxycholate 솔루션 다음 행렬의 세포를 분리하는 트립신 솔루션을 사용했습니다. 설명 프로토콜은보다 큰 2 L / 오랜 시간 동안 분 재관류 속도를 사용합니다. 세포 파편의 오염없이 조직에 대리인의 교통편을 허용 및 솔루션 변경과 결합 높은 유량은 조직의 린스 효과 보장. 설명 방법은 nati의 모든 핵 물질을 제거응용 프로그램의 다양한 사용할 수있는 특정 사이트 심장 ECM 비계를 만들고, 돼지의 심장 조직이 있어요.

프로토콜

1. 조직 준비 및 실험 설정

  1. 즉시 도살장 또는 연구 시설에서 안락사 이후 초과 피가 묻은 손을 씻어 수확 돼지의 기관. 심방과 대동맥을 그대로 유지 초과 지방 및 조직의 마음을 잘라. 거리에 대동맥에서 폐동맥을 분리 할 지방 트림. 조직에 상처가있는 경우, 적절하게 폐기하십시오.
  2. 냉동고 종이에 개별적으로 마음을 정리하고 완전한 냉동을 보장하기 위해 최소 24 시간에 -80 ° C의 냉동고에있는 모든 조직을 저장합니다.
  3. 할 때 사용 (보통 미만 3 개월), 밤 4 ° C.에서 4 L의 비커에 잠겨 1 형 물에 해동 한 그대로 냉동 돼지의 심장 준비
  4. 마음이 완전히 해동 한 후, 심장이 건조 두드려 마음을 무게, 그리고 무게를 기록합니다. 시장 무게 돼지의 심장은 약 3백75-4백50g 무게해야합니다.
  5. 가시 감속기의 ¼ "끝으로 크기를 18 Masterflex 관을 연결합니다. 가시 감속기를 넣고대동맥 내부 튜브. 단지 팔 머리 트렁크 아래의 장소 2 호스 클램프 또는 대동맥 주위 안전한 우편 관계. 감속기와 튜브는 대동맥 밸브 위에 유지해야하며, 관상 동맥이 (그림 1) perfused 할 수 있도록.
  6. 유형 I 물 튜브를 채우기 위해 30 또는 60 ML의 주사기를 사용합니다. 대략 중간 지점에 Masterflex 롤러 펌프의 카트리지 내에 튜브를 삽입합니다. 유입 물 2.5 L로 가득 4 L의 비커의 바닥에있는 튜브의 끝과 튜브를 확보 잠기.
  7. 물이 담겨있는 비커에 심장과 기포를 제거하는 주요 펌프를 놓으십시오. 거품이 튜브가 삽입되어있는 대동맥에서 오는 관찰하는 경우 대동맥 추가 관계로 재배치 또는 보안해야 할 수 있습니다. 밀폐 씰은 decellularization 프로세스 (그림 2)에 적절한 압력을 유지하는 것이 중요합니다.
  8. 0.2 % Trypsin/0.05 % EDTA/0.05 % 할머니 3 L를 포함하는 4 L의 비커를 놓고판을 저어 37에 따뜻하게에 ° C decellularization 과정의 준비 3 솔루션입니다.

2. 조직 린스

  1. 올바른 튜​​브 크기가 선택되어 있도록, 400 ML / 분의 유량으로 펌프를 설정합니다. 15-25 분 동안 I 물을 입력으로 마음을 플러시. 펌프가 시작되면서 마음은 팽창과 심실에서 혈액을 발산한다. 신선한 솔루션은 모든 5-10 분 대체, 또는 심장에서 제거 혈액의 양에 따라 필요합니다. 혈액은 심장에서 했소하지 않는 경우, 필요에 따라 튜브와 클램프를 조정합니다.
  2. 펌프를 중지하고 배 인산로 가득 별도의 비커에 마음을 전송할는 식염 (PBS)를 버퍼. 튜브는 솔루션에 잠수 한 후, 펌프를 시작하고 700 ML / 분으로 유량을 향상시킬 수 있습니다. 마음이 솔루션마다 5 분을 변경, 15 분에 대한 솔루션 유지됩니다. 각 솔루션 변경 사항은 조직과 튜브가 이동하는 동안 일시적으로 중지 할 펌프가 필요합니다새로운 비커합니다.
  3. 10 분에 I 물을 입력하고 750 ML / 분으로 유량을 증가 심장을 전송합니다.

3. Decellularization 및 솔루션 재관류

  1. 37 세 할머니 0.2 % Trypsin/0.05 % EDTA/0.05 %를 포함하는 비커에 마음을 전송 ° C. 1200 ML / 분에 펌프 속도를 증가하고 펌프를 시작합니다. 비커에 솔루션을 순환 할 수있는 비커의 바닥에 배치 저어 줄을 사용하십시오. 마음은 3 시간 총 37 ° C에서 0.2 % Trypsin/0.05 % EDTA/0.05 % 할머니 3 솔루션에 남아 있어야합니다. 1 시간 후, 1500 ML / 분에 펌프 속도를 향상시킬 수 있습니다. 추가 시간 후, 1800 ML / 분에 펌프 속도를 향상시킬 수 있습니다. 조직은 천천히 조건 조직을로 증가 관류 속도를 받게과 혈관의 파열을 방지합니다. 마음은 프로토콜이 단계에서 크기로 팽창 거의 두 번합니다. 조직 회에 걸쳐 심방에서 꼭대기까지 진행, 자연 색상을 잃게됩니다전자 프로토콜 (그림 3).
  2. 각 솔루션 재관류 후, 린스 두 단계는 세포 파편, 화학 잔류 물, 그리고 원조 세포 용해를 제거하는 수행됩니다. 각 린스은 10 분으로 구성되어 전 10 분 뒤에 물이 상온에서 2 배 PBS 솔루션을 씻어 유형에 씻어. 각 헛된 솔루션을 헹굼 추가, 침수 마음을 포함하고있는 비커 안에 perfusate를 순환, 원래 비커의 용액의 제거로 구성되어 있습니다. 다음 0.2 % Trypsin/0.05 % EDTA/0.05 % 할머니 3 해결책 후, perfuse 1900 ML / 분의 물과 1950 ML / 분에서 2 배 PBS를 perfuse.
  3. 3퍼센트 상온에서 튼 X-100/0.05 % EDTA/0.05 % 할머니 3의 솔루션으로 마음을 전송합니다. 2000 ML / 1 시간 분, perfuse 솔루션에 펌프 속도를 향상시킬 수 있습니다. 비커의 용액을 제거하고 신선한 솔루션으로 교체 2100 ML / 분에 펌프 속도를 높일 수 있으며, 추가 시간 반 동안 신선한 솔루션을 perfuse, 총 시간을 가져3퍼센트 튼 X-100/0.05 % EDTA/0.05 % 할머니 3 2.5 시간합니다.
  4. 2180 ML / 10 분 각각에 대한 분에 2150 ML / 분, 배 PBS에서 유형 I 물에 조직을 씻어.
  5. 실온에서 4 % 나트륨 Deoxycholate 솔루션에 마음을 전송합니다. 2200 ML / 분, 3 시간에 perfuse 솔루션에 펌프 속도를 향상시킬 수 있습니다.
  6. 에서 유형 I 물에 조직을 씻어 배 PBS 2200에서 각 솔루션 5-10 분 후 솔루션을 변경하는 15 분마다에 대한 ML / 분. 설명 재관류 단계는 두 번 헹굼 단계를 수행, 4 ° C에서 하루 아침에 첨부 된 튜브로 마음을 저장하여 여러 일 동안 분할 및 유형 I 물에 잠겨 할 수 있습니다.
  7. 다음 날, 5 분 ML / 분 1,500에서 1X PBS로 씻어 5 분 뒤에, 750 ML / 분에서 유형 I 물로 씻어 수행합니다. 프로토콜은 다음 적절한 솔루션에 설명 된 유속으로 계속 될 수 있습니다.

4. 소독 및 최종 처리

  1. 0.1 % perac로 마음을 전송etic 산 / 2200 ML / 분에서 4 %의 에탄올 솔루션과 1.5 시간에 대한 perfuse 솔루션입니다.
  2. 조직에 대한 최종 린스는 모두 2200 ML / 분에서 수행됩니다. 유형 I 물에 두 개의 5 분 세차 다음 15 분을 위해 1X PBS로 조직을 Perfuse. 린스의이 시리즈는 솔루션 재관류 절차를 완료하기 위해 한번 더 반복됩니다.
  3. 펌프를 끄고 마음을 배수하는 솔루션에서 마음을 제거합니다. 대동맥의 인연을 끊고, 모든 튜브를 제거하고 1 시간에 소모 할 수있는 빈 비커에 마음을 놓으십시오. 초과 액체는 정기적으로 배수해야합니다. 완전히 마음 (그림 4) 배수하기 위해 흡수 패드에 마음을 놓는다.
  4. 물 대부분이 제거되면 심장 세포 외 기질 (C-ECM)의 무게를 기록합니다. 심장은 decellularization 과정에서 초기 체중의 약 20~25%을 잃게 할 것으로 예상 할 수 있습니다.
  5. 오른쪽과 왼쪽 심실뿐만 아니라, DNA quantificati에 대한 심실 중격을 관통 해부와 조직 학적 처리 위해서는 조직 전체 decellularization (그림 5) 확인합니다.
  6. lyophilization 전에 최소한 2 시간에 -80 ° C에서 C-ECM을 멈춰 봐.

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결과

전체 돼지의 마음에 decellularization의 효과는 자연적으로 크기의 차이, 압력 및 선박 배열로 인해 다릅니다. 따라서 파생 된 세포 외 기질 공사장 공중 발판의 정확한 구성은 마음에서 마음으로 동일하지 않습니다. 설명 프로토콜의 완성은 세포 물질의 손실을 나타내는 흰색 또는 반투명 나타납니다 마음을 얻을 것입니다. 그러나, 널리 조직이 몇 양적 매개 변수 팔의 조합에 따라 "decellularized"로 간주 될 수 있다는 가능합니다. 성공적인 decellularization 프로토콜은 조직의 MG 당 두 번 좌초 DNA (그림 6)의 50 미만 NG와 함께 매트릭스를 생성합니다. 매트릭스의 주입시 호스트 면역 반응을 방지하기 위해, 나머지 DNA는 200m 미만의 기본 쌍 (그림 7)를 포함해야합니다. 이러한 연구 결과를 확인하려면 Hematoxylin과 Eosin 염색은 핵의 부재를 공개해야심실과 심실 간 중격 <...

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토론

현재 연구는 돼지의 마음의 일관되고 효율적인 decellularization에 대한 방법론을 설명했다. 프로토콜은 이전에 다음 ID로 출판 보고서 1 변형 등의 반복적 인 결과를 제공 흐름에 더 이상 노출 증가 압력을, 포함되어 있습니다. 그 결과 decellularized 조직은 조직이 성공적으로 decellularization에 게시 된 기준을 모두 만났다. 자주 솔루션으로 변경되며, 변경된 사항은 조직에 세포 물질의 재 도입을 제한하기 위해 수행되었으며, 각 decellularization 에이전트에 노출 기간은 ECM에 부정적 영향을 줄이기 위해 최소화했다. 프로토콜의 시작 단계 동안, 재관류 율이 점차 조건 조직을로 증가하고 프로토콜의 이후 단계에서 높은 유량을 허용했다. 초기 단계에서 에어컨 조직을하지 않고 마음의 vasculature는 심장의 재관류가 불가능하고, 파열 할 수 있습니다. proto열은 그 효율성으로 인해 사용되었고, 어떤 주장이 다른 프로토콜을 통해 그 우수성...

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공개 사항

길버트 박사는 연구가 완료하는 동안 ACell 주식회사에서 과학 자문위원회에 있었는데, 최근 연구 및 개발의 부사장이되었다. ACell, Inc는 방광 매트릭스을 판매하고 본 연구에 상업적 관심이 없습니다.

감사의 글

저자는 Brogan, 손님 미셸 위버, 그리고 순영이 Lippert을 인정하고 싶습니다. 본 연구를위한 기금은 NIH 그랜트 R03EB009237뿐만 아니라 국민의 생명 이미징 및 생물 공학 연구소와 T32HL076124-05에서 NIH 교육 교부금 T32EB001026-06에 의해 제공되었다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
시약 / 재료의 이름 회사 카탈로그 번호 코멘트
트립신 Gibco 15,090
EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) 어부 BP120-500
앤 3 시그마 S2002-500G
트리톤 X-100 시그마 X100-1L
10X PBS 어부 BP399-20
나트륨 Deoxycholate 시그마 D6750-500G
Peracetic 산 Pfaltz와 바우어 P05020 35% CAS # 79-21-0
에탄올 Pharmco 111000200
Masterflex 펌프 드라이브 콜 Parmer SI-07524-50
Masterflex 관 콜 Parmer 96400-18 크기 18
가시 감속기 콜 Parmer EW-30612-20
4L 비커 피셔 과학 02-540T

참고문헌

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