신속하고 완벽하게 역행 재관류를 통해 그대로 돼지의 심장에서 세포 구성 요소를 제거하는 방법이 설명되어 있습니다. 이 방법은 여러 임상 응용 프로그램에서 사용하기 위해 가능성이있는 사이트 특정 심장 세포 외 기질 비계를 산출.
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이 논문에서
요약
초록
크게 비계의 기본 구조를 유지하면서 재관류 기반 전체 오르간 decellularization은 최근, 특정 사이트 세포 외 기질 공사장 공중 발판을 만들 수있는 수단으로 조직 공학 분야에 대한 관심을 얻었습니다. 현재까지이 방식은 심장, 폐, 간 1-5을 포함한 장기 시스템의 다양한 활용되었습니다. 쉽게 접근 할 수 혈관 네트워크가없는 조직에 대한 이전 decellularization 방법은 세제, 산, 또는 주변 세포 환경 6-8에서 세포와 핵 구성 요소를 제거하는 수단으로 효소 트리트먼트 솔루션에 조직의 장시간 노출시 의존하고 있습니다. 그러나, 솔루션의 능력에 따라 이러한 방법 힌지의 효과는 확산을 통해 조직을 침투합니다. 대조적으로, 자연 혈관 시스템을 통해 기관의 재관류 효과적으로 확산 거리와 decellularizati의 촉진 수송을 감소조직에서 조직과 세포의 구성 요소에 에이전트 있습니다. 여기, 우리는 완전히 관상 동맥 재관류 역행을 통해 그대로 돼지의 심장을 decellularize하는 방법을 설명합니다. 프로토콜은 그대로 심장의 3 차원 구조를 완벽하게 decellularized 심장 세포 외 기질 (C-ECM) 비계를 굴복. 우리의 방법은 효소, 세제, 그리고 세포의 용해 및 제거에 도움 hypertonic과 hypotonic 린스와 커플 링 산 일련의를 사용했습니다. 프로토콜은 세포 물질의 제거에 도움 튼 X-100과 나트륨 deoxycholate 솔루션 다음 행렬의 세포를 분리하는 트립신 솔루션을 사용했습니다. 설명 프로토콜은보다 큰 2 L / 오랜 시간 동안 분 재관류 속도를 사용합니다. 세포 파편의 오염없이 조직에 대리인의 교통편을 허용 및 솔루션 변경과 결합 높은 유량은 조직의 린스 효과 보장. 설명 방법은 nati의 모든 핵 물질을 제거응용 프로그램의 다양한 사용할 수있는 특정 사이트 심장 ECM 비계를 만들고, 돼지의 심장 조직이 있어요.
프로토콜
1. 조직 준비 및 실험 설정
- 즉시 도살장 또는 연구 시설에서 안락사 이후 초과 피가 묻은 손을 씻어 수확 돼지의 기관. 심방과 대동맥을 그대로 유지 초과 지방 및 조직의 마음을 잘라. 거리에 대동맥에서 폐동맥을 분리 할 지방 트림. 조직에 상처가있는 경우, 적절하게 폐기하십시오.
- 냉동고 종이에 개별적으로 마음을 정리하고 완전한 냉동을 보장하기 위해 최소 24 시간에 -80 ° C의 냉동고에있는 모든 조직을 저장합니다.
- 할 때 사용 (보통 미만 3 개월), 밤 4 ° C.에서 4 L의 비커에 잠겨 1 형 물에 해동 한 그대로 냉동 돼지의 심장 준비
- 마음이 완전히 해동 한 후, 심장이 건조 두드려 마음을 무게, 그리고 무게를 기록합니다. 시장 무게 돼지의 심장은 약 3백75-4백50g 무게해야합니다.
- 가시 감속기의 ¼ "끝으로 크기를 18 Masterflex 관을 연결합니다. 가시 감속기를 넣고대동맥 내부 튜브. 단지 팔 머리 트렁크 아래의 장소 2 호스 클램프 또는 대동맥 주위 안전한 우편 관계. 감속기와 튜브는 대동맥 밸브 위에 유지해야하며, 관상 동맥이 (그림 1) perfused 할 수 있도록.
- 유형 I 물 튜브를 채우기 위해 30 또는 60 ML....
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결과
전체 돼지의 마음에 decellularization의 효과는 자연적으로 크기의 차이, 압력 및 선박 배열로 인해 다릅니다. 따라서 파생 된 세포 외 기질 공사장 공중 발판의 정확한 구성은 마음에서 마음으로 동일하지 않습니다. 설명 프로토콜의 완성은 세포 물질의 손실을 나타내는 흰색 또는 반투명 나타납니다 마음을 얻을 것입니다. 그러나, 널리 조직이 몇 양적 매개 변수 팔의 조합에 따라 "decellularized"로 간주 될 수 있다는 가능합니다. 성공적인 decellularization 프로토콜은 조직의 MG 당 두 번 좌초 DNA (그림 6)의 50 미만 NG와 함께 매트릭스를 생성합니다. 매트릭스의 주입시 호스트 면역 반응을 방지하기 위해, 나머지 DNA는 200m 미만의 기본 쌍 (그림 7)를 포함해야합니다. 이러한 연구 결과를 확인하려면 Hematoxylin과 Eosin 염색은 핵의 부재를 공개해야심실과 심실 간 중격 <.......
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토론
현재 연구는 돼지의 마음의 일관되고 효율적인 decellularization에 대한 방법론을 설명했다. 프로토콜은 이전에 다음 ID로 출판 보고서 1 변형 등의 반복적 인 결과를 제공 흐름에 더 이상 노출 증가 압력을, 포함되어 있습니다. 그 결과 decellularized 조직은 조직이 성공적으로 decellularization에 게시 된 기준을 모두 만났다. 자주 솔루션으로 변경되며, 변경된 사항은 조직에 세포 물질의 재 도입을 제한하기 위해 수행되었으며, 각 decellularization 에이전트에 노출 기간은 ECM에 부정적 영향을 줄이기 위해 최소화했다. 프로토콜의 시작 단계 동안, 재관류 율이 점차 조건 조직을로 증가하고 프로토콜의 이후 단계에서 높은 유량을 허용했다. 초기 단계에서 에어컨 조직을하지 않고 마음의 vasculature는 심장의 재관류가 불가능하고, 파열 할 수 있습니다. proto열은 그 효율성으로 인해 사용되었고, 어떤 주장이 다른 프로토콜을 통해 그 우수성.......
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공개 사항
길버트 박사는 연구가 완료하는 동안 ACell 주식회사에서 과학 자문위원회에 있었는데, 최근 연구 및 개발의 부사장이되었다. ACell, Inc는 방광 매트릭스을 판매하고 본 연구에 상업적 관심이 없습니다.
감사의 글
저자는 Brogan, 손님 미셸 위버, 그리고 순영이 Lippert을 인정하고 싶습니다. 본 연구를위한 기금은 NIH 그랜트 R03EB009237뿐만 아니라 국민의 생명 이미징 및 생물 공학 연구소와 T32HL076124-05에서 NIH 교육 교부금 T32EB001026-06에 의해 제공되었다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 시약 / 재료의 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 코멘트 |
| 트립신 | Gibco | 15,090 | |
| EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) | 어부 | BP120-500 | |
| 앤 3 | 시그마 | S2002-500G | |
| 트리톤 X-100 | 시그마 | X100-1L | |
| 10X PBS | 어부 | BP399-20 | |
| 나트륨 Deoxycholate | 시그마 | D6750-500G | |
| Peracetic 산 | Pfaltz와 바우어 | P05020 | 35% CAS # 79-21-0 |
| 에탄올 | Pharmco | 111000200 | |
| Masterflex 펌프 드라이브 | 콜 Parmer | SI-07524-50 | |
| Masterflex 관 | 콜 Parmer | 96400-18 | 크기 18 |
| 가시 감속기 | 콜 Parmer | EW-30612-20 | |
| 4L 비커 | 피셔 과학 | 02-540T |
참고문헌
- Ott, H. C., et al. Regeneration and orthotopic transplantation of a bioartificial lung. Nat. Med. 16, 927-933 (2010).
- Ott, H. C., et al. Perfusion-decellularized matrix: using nature's platform to engineer a bioartificial heart. Nat. Med<....
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재인쇄 및 허가
