바이오 매스의 제한 금액을 사용하여 효율적으로 염색질 immunoprecipitation의

요약

우리는 기본 T 세포를 사용하여 염색질의 immunoprecipitation위한 강력한 방법을 설명합니다. 이 방법은 표준 방법에 설립 있지만, 세포의 제한된 수량에 대한 효율성을 개선 조건과 시약의 특정 집합을 사용합니다. 중요한 데이터 분석 단계에 대한 자세한 설명이 표시됩니다.

초록

염색질의 immunoprecipitation (칩)은 살아있는 세포의 염색질의 DNA와 다른 단백질의 상호 작용을 결정하는 데 널리 사용되는 방법입니다. 예를 들면 시퀀스 특정 DNA 결합 전사 인자, 히스톤과 다른 수정 상태와 같은 RNA 중합 효소와 보조 인자와 같은 효소와 DNA 복구 구성 요소를 포함. 그 편재에도 불​​구하고, 소재 모두 벤치 준비 및 상호 작용의 정량적 측정을 허용 정확한 분석을위한 최신 상세한 방법론의 부족이있다. 정보의 부족으로 인해, 또한 어떤 면역 침전과 같은 조건이 실험 조건의 새로운 집합에 대해 다시 최적화해야하기 때문에 칩의 분석은 부정확하거나 잘못 정량 결과에 감염 될 수 있습니다.

우리의 프로토콜은 궁극적으로 전사 인자에 정액 일에서 파생됩니다 DNA 상호 작용 ^{1,2,하지만} sensiti에 개선의 번호를 통합하기 어려운 얻을 세포 유형에 대한 VITY 및 재현성. 프로토콜이 성공적으로 사용되어왔다 ^3,4, DNA 농축을 정량화하기 qPCR에 사용하거나, 아래의 프로토콜의 반 정량적 인 변형을 사용하여 두.

PCR 증폭 물질이 정량적 분석은 계산 수행 및 분석에 제한 요소를 나타냅니다. 중요한 컨트롤 및 기타 고려 사항에 따라 변경을 표시하지 않는 등 연구중인 단백질 (또는 예상에 구속되지 않도록 예측 intergenic 지역으로 이소 타입을 맞춘 항체의 사용뿐만 아니라 게놈 DNA의 제어 영역의 평가를 포함 실험 조건). 또한, 모든 칩 샘플에 대한 입력 자료의 표준 곡선은 실험 물질에 농축의 절대 수준을 도출하는 데 사용됩니다. 표준 곡선의 사용에 관계없이 설계하는 방법을주의 깊게의 프라이머 세트 사이에 계정의 차이를 고려하고, 또한 효율이 다를 수 있습니다하나의 프라이머 세트에 대한 템플릿 농도의 범위에 걸쳐 ences. 우리 프로토콜은 우리가 광범위 나중에 분석 단계를 포함한다는 점에서 ^5-8 사용할 수있는 다른 사람과 다른 것입니다.

프로토콜

1. 마우스 비장 나이브 CD4의 분리는 세포를 T

1. 기관 애니멀 케어 및 사용위원회 (IACUC) 프로토콜과 일치하는 인간적인 방식으로 마우스를 희생. 비장을 해부하고 10 % FBS와 DMEM 10 ML을 포함하는 페트리 접시에 넣습니다.
2. 비장 세포를 분리하기 위해 두 개의 유리 슬라이드의 서리로 덥은 끝을 사용하여 비장을 분쇄. 15 ML 원뿔 튜브에 세포 현탁액을 전송합니다.
3. 4시 5 분 200 XG (일반 로터 직경 임상 원심 분리기에 대한 ~ 1,200 RPM)에서 원심 분리하여 세포를 수집 ° C.
4. 2 ㎖ ACK 버퍼를 Resuspend 세포는 적혈구, 실온 (RT)에서 1 분을 용해합니다. FBS와 DMEM의 13 ML을 추가하여 반응을 중지합니다.
5. 4시 5 분 200 XG에서 원심 분리하여 세포를 수집 ° C.
6. DMEM 포함 FBS 5 ML에있는 세포를 resuspend을하고 70 μm의 메쉬 필터 (BD 팔콘, 고양이 # 352350)를 통해 전달합니다. 세포를 계산하고 진행순진 CD4의 분리에 대한 제조 업체의 지침을 사용하여 CD4 분리 키트 (있는 Miltenyi, 고양이 # 130-095-248)를 사용하여 세포가 T. 4시 5 분 200 XG에서 원심 분리하....

결과

염색질의 immunoprecipitation (칩) 프로토콜은 따라서 "로드 관리"역할, 게놈의 언 바운드 영역을 증폭 프라이머 쌍의 사용을 통해 PCR에 사용되는 DNA의 양 (있는 경우), 차이 여기에 컨트롤을 선보였다. 그림 3의 예제에서, 우리는 대상 영역으로 마우스 IL2 발기인에 대한 관심과 전사 인자 NFAT 바인딩 사이트의 우리의 단백질 지역 언 바운드로 마우스 Actb 유전자의 코딩 영역을 사용했습니다. 또한, 관심의 단백질에는 결합이없는 것으로 알려져 타겟 지역의 상류 또는 하류 지역에 몇 킬로베이스는이 목적을 위해 선택할 수 있습니다. 대상 지역의 프라이머 쌍을 디자인 할 때, PCR 제품의 이상적인 크기는 약 100 ~ 200 BP입니다. 계산이 프라이머는 게놈의 다른 곳 바인딩하지 않는지 확인하는 것도 중요하다.

차이에 바인딩 단백질의 상대적인 풍부이소 타입 제어 및 특정 .......

토론

프로토콜은 위에 정확하게 칩을 사용하여 기본 림프구의 DNA 농축을 정량화하는 강력한 방법을 제공합니다. 이 프로토콜의 안정성에 대한 하나의 주요 이유는 생물학적가 복제를 포함합니다. 위의 프로토콜은 세 가지가 독립적으로 계산되는 농축을 복제합니다. 출력은 다음 농축과 변화의 측정을 제공하기 위해 계산 된 표준 편차의 정도를 제공하기 위해 평균한다. 각 샘플은 세 가지 기술은 또한 샘플 처리의 변화, PCR 증폭 등의 기술적 인 반복의 변화의 양이 다른 생물 학적 샘플 사이에 관찰 된 것보다 일반적으로 훨씬 적다을 제거하기 위해 수행하는 복제합니다. 견고성에 대한 두 번째 이유는 이소 타입 - 대조군 항체, 표준 입력 DNA 곡선의 사용 및 비 특정 게놈 영역에 해당하는 컨트롤의 amplicon의 사용을 포함한 여러 기술 컨트롤을 포함합니다.

제한은 일반적으로 칩을 사용하여 발생하는 것과 유사하다. 방법은 다소 빈약 한 공간 분해능을 앓고,.......

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
포름 알데히드	시그마	F-8775	RT
인산염 완충 식염수	Hyclone	SH30256.01	4 °에 저장; C
프로테아제 억제제 정제	Roche	04693116001	4 °에 저장; C
단백질 G 마그네틱 비즈	액티브 모티프	101945	4 °에 저장; C
RNase A (20 mg/ml)	EMD Millipore	556746	-20 °에 저장; C
단백질 분해 효소 K (20 mg / ml)	Roche	03115879001	50 mM Tris-HCl, 10 mM CaCl2< / sub>, pH 8.0
Platinum Taq DNA Polymerase	Invitrogen	10966-034	-20 °C에 보관; C
SYBR Green I	Invitrogen	S7567	-20 ° C
1 M 글리신			RT
세포 용해 완충액에 보관 (5 mM 파이프, pH 8.0; 85 mM KCl; 0.5 % NP-40)			4 °C에 보관; C
핵 용해 완충액 (50 mM Tris, pH 8.1; 10 mM EDTA; 1 % SDS)			RT
ChIP 희석 완충액 (0.01 % SDS; 1.1 % Triton X-100; 1.2 mM EDTA; 16.7 mM Tris pH 8.1; 190 mM NaCl)			°C에 보관; C
저염 세척 완충액 (0.1 % SDS, 1 % 트리톤 X-100, 2 mM EDTA, 20 mM 트리스 pH 8.1, 150 mM NaCl)			4 °C에서 보관; C
고 염분 세척 완충액 (0.1 % SDS; 1 % 트리톤 X-100; 2 mM EDTA; 20 mM 트리스 pH 8.1; 600 mM NaCl)			4 °C에서 보관; C
LiCl 세척 완충액 (0.25 M LiCl; 1 % NP-40; 1 % 나트륨 데 옥시 콜레이트, 1 mM EDTA, 10 m 트리스 pH 8.0)			4 °C에서 보관; C
TE 완충액 (10 mM Tris, pH 7.4, 1 mM EDTA)			4 °C에서 보관; C
용리 완충액 (1 % SDS; 0.1 M NaHCO3< / sub>)			RT에서 새로운
5 M NaCl			저장
0.5 M EDTA			RT
에서 저장 1 M Tris-HCl, pH 6.5			RT
특정 시약 표< / strong>
Clay Adams 브랜드 Nutator	Becton Dickinson	모델: 421105
마그네틱 스탠드	Promega	Z5342
Qiaquick PCR 정제 키트	Qiagen	28106
Masonix Sonicator 3000	QSonica	모델: S3000
UV 분광 광도계	NanoDrop Technologies	ND-1000
가열 블록	VWR	13259-030
회전자	VWR	80085-692
냉장 벤치 탑 원심 분리기	Beckman Coulter	모델: Allegra X-12R
마이크로 원심분리기	Eppendorf	5415 D
장비 테이블

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