방법 논문

철 소스로 인간 혈색소를 사용하여 황색 포도상 구균 성장

DOI:

10.3791/50072

⸱

2013년 2월 7일

 ,  , 
1Department of Pathology, Microbiology and Immunology, Vanderbilt University Medical School

이 논문에서

요약

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여기에 대한 성장 분석을 설명 포도상 구균 사용 가능한 영양 철의 단독 소스로 헤모글로빈을 사용합니다. 이 분석은 헤모글로빈 - 파생 철 인수에 참여 세균 요소의 역할을 설정합니다.

초록

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S. 구균이 중요한 신진 대사 기능과 원인 질환을 수행 할 철 필요로하는 병원성 세균입니다. 인간의 호스트 내부의 철의 가장 풍부한 저수지는 헤모글로빈의 cofactor이다 헴입니다. 헤모글로빈의 철을 취득하려면, S. 구균은 철 - 규제 표면 결정자 (Isd) 시스템 1로 알려진 정교한 시스템을 활용합니다. Isd 시스템 첫째 바인드 호스트 헤모글로빈의 구성 요소는 다음 추출하고 헴을 가져, 그리고 마지막으로 박테리아 세포질 2,3에 헴의 철을 해방. 이 경로는 체외 연구 4-9에서 수많은 통해 해부되었습니다. 또한, 감염 Isd 시스템의 후원금이 반복적으로 마우스 모델 8,10-14에서 입증되었습니다. 헤모글로빈 - 파생 철 수집에 Isd 시스템의 기여를 설립하고 성장은 점점 더 어려워 것으로 증명되었습니다. 단독 철 소스로 헤모글로빈을 사용하여 성장 assays는 B 복잡y는 성장 매체에 무료로 철을 오염 상업적으로 이용 가능한 헤모글로빈의 불안정, 그리고 철 chelators과 관련된 독성. 여기 우리는 이러한 한계를 극복하는 방법을 제시한다. 고품질의 헤모글로빈은 신선한 혈액 준비되어 있으며 액체 질소에 저장됩니다. 정화 헤모글로빈이로 보완되어 매체는 척추 호스트 내부의 병원균에 의해 발생 철 - 가난한 환경을 모방 철 (iron) - 고갈시킵니다. S.를 굶주리고하여 무료 철의 구균과 우리가 헤모글로빈을 묶는 헴를 추출, 세균 세포 봉투를 통해 헴에 합격하고 세포질에서 헴을 저하 할 수있는 능력에 전적으로 의존하는 방식으로 성장을 유도 헤모글로빈의 최소한 조작 양식을 보완. 이 분석은 S.에 hemoglobin-/heme-derived 철 획득의 메커니즘을 명료하게하다하고자하는 연구자에 유용합니다 구균 및 기타 세균 병원체.

프로토콜

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1. 신선한 혈액에서 헤모글로빈의 정화

  1. 항응고제로 보충 신선한 인간의 피를 취득. 정화에 걸쳐 얼음이나 4에 혈액 ° C세요.
  2. 1500 X g에서 20 분 피를 원심 분리기. 적혈구은 (적혈구) 튜브의 하단에 있습니다. 조심스럽게 표면에 뜨는을 대기음 부드럽게 얼음처럼 차가운 0.9 % (w / V) NaCl 용액에서 펠렛을 resuspend. 원심 분리를 반복 3 회 씻는다.
  3. 얼음처럼 차가운 10 MM 트리스 - HCL (산도 8.0) 1 볼륨에 펠렛을 Resuspend. 이 삼투압에 의한 적혈구의 용해를 유도합니다. ~ 20 % 최종 볼륨에 톨루엔을 추가합니다.
  4. 밤새 회전 통닭에 4 ° C에서 알을 품다.
  5. 1 시간에 20,000 XG에서 lysate를 원심 분리기. 톨루엔 (상단에 떠있는)와 펠렛 훼손되지 않은 떠나 중간 hemolysate 분수를 수집합니다. 중앙 분수를 수집하는 긴 목 피펫을 사용합니다.
  6. 0.44 μm 주사기 필터를 통해 전달합니다. 솔루션은 미립자가 포함 된 경우물질과는 단계 1.5를 반복 필터를 통과 할 수 없습니다.
  7. 고성능 액체 크로마토 그래피와 헤모글로빈 (HB)를 정화 (HPLC) 음이온 교환 컬럼 (Varian, PL-SAX 100....

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결과

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우리는 HPLC (프로토콜 단계 1.7)로 hemolysate 인간의 헤모글로빈을 정화하고 있습니다. 그림 1은 쇼 280과 410 나노 미터 파장에서 eluate의 흡광도를 기록. 비율 5 수집 된 및 다른 분수이 삭제되었습니다. eluate의 밀리리터 당 헤모글로빈의 5-15 밀리그램의 생산량은 일반적으로 취득하고 있습니다. 정화 헤모글로빈이 중복으로 SDS-PAGE에 의해 분석되었으며 젤은 어느 단백질에 물들 또는 니트로 셀룰로스에 전송 된 및 (프로토콜 단계 1.10, 그림 2) immunoblotted.

우리는 야생 유형의 성장을 지원하기 위해 인간의 헤모글로빈을 정화하는 능력을 평가 한 S. 구균과 S. Isd 시스템 (Δ isdB)의 IsdB 구성 요소를 결여 구균. IsdB는 헤모글로빈 파생 철 취득 12 필요합니다 헤모글로빈 수용체입.......

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토론

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철은 인생 15 모든 왕국에서 생물에 필요한 필수 영양소입니다. vertebrates에서, 철은이 요소로 인한 독성을 피하기 위해 분리되어 있습니다. 이 격리은 영양 면역 16로 알려진 과정에 미생물을 침해에서 철을 은폐합니다. 대응 병원균은 영양 면역을 회피 전략을 발전시켜 왔습니다. 하나의 메커니즘 헤모글로빈에 의존되는데,이 호스트 17에서 철의 가장 풍부한 원천입니다. 헤모글로빈은 적혈구 안에 포함되어 있습니다. 손상된 적혈구에서 출시 혈색소는 대 식세포 18 일 haptoglobin - 헤모글로빈 단지의 급속한 제거 신호를 호스트 haptoglobin에 의해 구속된다. 헤모글로빈에 액세스하기 위해, S. 구균은 적혈구에게 19 lyse hemolysins을 표현한다. Haptoglobin 유도 헤모글로빈 제거는에 의해 표현 세포 표면 수용체에 의해 헤모글로빈의 높은 친 화성 바인딩에 의해 반박된다

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공개 사항

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우리는 공개 할 아무 것도 없습니다.

감사의 글

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이 연구는 알레르기 및 전염병 국립 연구소에서 미국 공중 보건 서비스 보조금 AI69233 및 AI073843에 의해 지원되었다. EPS는 전염병의 Pathogenesis에 버로우즈 웰컴 동지이다. KPH는 세포 및 분자 미생물학 교육 보조금 프로그램 5 T32 A107611-10로 운영되었습니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
시약 / 재료의 이름 회사 카탈로그 번호 코멘트
HPLC의 음이온 교환 컬럼 Varian PL1551-3802
Drabkin의 시약 시그마 D5941-6VL
헤모글로빈 표준 포인트 과학 H7506-STD
RPMI HyClone SH30011.02
Chelex 100 나트륨 양식 시그마 C7901
EDDHA LGC 표준 GmbH의 ANC 001
헤모글로빈 항체 산타 크루즈 (Santa Cruz) 생명 공학, Inc의 SC-21005
Tryptic 콩 한천 BD 236920

참고문헌

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Mazmanian, S., et al. Passage of heme-iron across the envelope of Staphylococcus aureus. Science. 299, 906-909 (2003).
  2. Pishchany, G., Skaar, E. P. Taste for blood: hemoglobin as a nutrient source for pathogens. PLOS Pathogens. 8, e1002535(2012).
    3. <....

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