우리는 T 세포 활성화 과정 중에 단백질 역학에 대한 통찰력을 제공하는 라이브 세포 이미징 방법을 설명합니다. 우리는 정량적 인 결과는 T 세포 활성화에 걸쳐 복잡한 형성 신호를 따라 열매를 산출하는 T 세포의 확산 분석, 공 촛점 현미경 및 이미징 분석의 결합 사용을 보여줍니다.
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방법 논문
T 세포의 실시간 라이브 영상은 복잡한 형성을 신호
* These authors contributed equally
이 논문에서
요약
초록
전염성 질병에 대한 보호는 면역 시스템 1,2에 의해 중재된다. T 림프구는 여러 면역 세포 3,4의 활성화와 반응을 조절, 면역 시스템의 마스터 코디네이터입니다. T-세포의 활성화는 항원 제시 세포 (APC를)에 의해 표시되는 특정 항원의 인식에 따라 달라집니다. T 세포 항원 수용체 (TCR)는 각 T 세포 클론에 특정한 항원 특이성 5를 결정합니다. 항원에 TCR의 바인딩은 TCR 복합 구성 요소의 인산화를 유도합니다. T 세포 활성화를 촉진하기 위해이 신호는 같은 TCR에 신호 단백질의 모집 등 다양한 중요한 응답을 시작, 막의 세포질과 핵 형질해야하며 APC 사이트 (면역 시냅스), 자신의 분자 활성화, 골격 재 배열, 세포 내 칼슘 농도의 상승, 유전자 발현 6,7의 변화. 에서 올바른활성화 신호의 itiation 및 종료 적절한 T 세포 반응을 위해 매우 중요합니다. 신호 단백질의 활동은 단백질 - 단백질 상호 작용의 형성과 종료에 따라 달라집니다, 이러한 단백질 인산화 단백질 복합체, 단백질의 ubiquitylation 다양한 휴대 사이트 8 단백질의 모집 형성으로 번역 수정을 게시 할 수 있습니다. T-세포 활성화 과정의 내부 동작을 이해하는 것은 면역 학적 연구와 임상 응용 프로그램 모두에 매우 중요합니다.
다양한 분석은 단백질 - 단백질 상호 작용을 조사하기 위해 개발되었습니다, 그러나, 널리 사용되는 공동 immunoprecipitation의 방법으로 생화학 적 분석은, 따라서 세포의 역학에 대한 귀중한 통찰력의 관찰을 배제, 단백질의 위치가 식별 될 수 없습니다 메커니즘. 또한 이러한 대량 분석은 일반적으로 t의 다른 단계에있을 수있는 많은 다른 세포에서 단백질을 결합그는 세포 프로세스를 조사 하였다. 이 시간 해상도에 해로운 영향을 미칠 수 있습니다. 살아있는 세포의 실시간 영상의 사용은 따라서 공정 9,10의 역학에 빛을 흘리는, 단백질의 공간적 추적 및 시간적 신호 이벤트를 구별 할 수있는 능력을 모두 할 수 있습니다. 우리는 T 세포 활성화 중에 신호 복잡한 형성의 실시간 영상의 방법을 제시한다. 기본 T 세포 또는 인 Jurkat 같은 T - 세포 라인, 비 생리적 인 올리고머 11을 방지 단량체 형광 단백질에 융합 관심의 단백질에 대한 인코딩 플라스미드 형질 전환됩니다. 라이브 T 세포는 특정 활성화 항원에 대한 필요성을 극복하면서 T 세포의 활성화를 유도 CD3/TCR 복합체에 결합 T-세포 활성화 항체 8,9와 coverslip을 미리 코팅을 통해 삭제됩니다. 활성화 된 세포는 지속적으로 공 촛점 현미경의 사용으로 몇 군데 있습니다. 영상 데이터는 COL과 같은 정량적 인 결과를 산출하기 위해 분석신호 단백질의 ocalization 계수.
프로토콜
1. T-세포의 형질
- Nucleofector 솔루션 키트의 "보충"솔루션을 혼합하여 활성화 Amaxa Nucleofector 솔루션을 준비합니다. 활성화 된 솔루션은 3 개월까지에 대해 4 ° C에 저장할 수 있습니다.
- 문화 매체 인 Jurkat T 세포를 증가 【10 % 소 태아 혈청 (FCS), 1 % 페니실린 - 스트렙토 마이신 솔루션, 2 RPMI에서 mM의 L-글루타민]. 최적의 세포는 1-2주 해동 후 사용한다. 로그 성장 세포 배양을 사용하여 높은 형질 전환 효율과 세포의 생존을 위해 매우 중요합니다. 또는 약간의 수정과 함께,이 프로토콜은 기본 T 세포와 함께 사용할 수 있습니다, 앞에서 8을 설명했다. 그것은 기본 T 세포의 활성화 과정의 기간 더 긴 인 Jurkat T 세포 (~ 30 분)보다 것을 강조되어야한다, 현미경 단계 배양 시스템은 CO 2, 전역 습도와 온도를 유지하는 데 사용해야 장착 활성화 프로세스입니다.
- 5 수집15 ML 튜브에 형질 전환 당 × 10 6 로그 상 T 세포.
- 400 7 분 × g, 실온에서를위한 세포를 원심 분리기.
- 원심 분리하는 동안 6 잘 플레이트를 준비합니다. 37 5 ML 문화 매체 및....
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결과
우리는 살아있는 T 세포 이미징 및 분석의 예를 제시한다. 영상 실험에 앞서, SLP76 결핍 T 세포 (J14)는 형광 단백질 (그림 1)의 발현을 결정하는 FACS의 사용으로 분석 하였다. 태그 신호 단백질 MCFP - NCK와 SLP76-mYFP로 형질 전환 된 T 세포는 활성화 슬라이드를 통해 입금 및 T 세포의 확산 (그림 2) 중 몇 군데 있었다. 수집 된 이미지 활성화 및 (그림 3) 확산을 통해 단백질 지방화의 역 동성을 보여줍니다. 인간의 편견을 최소화하면서 컴퓨터 이미지 처리, 새로운 통찰력과 시각 세포의 정량적 정보를 제공합니다. 세포의 활성화 과정을 통해 두 단백질의 colocalization을 검토하기 위해, 우리는 Imaris 소프트웨어 (비트 플레인 AG, 취리히 스위스)의 colocalization을 도구를 활용. 몇 군데 세포에 걸쳐 서로 다른 시간 지점 사이 colocalization을 계수를 비교하여, .......
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토론
여러 세포 프로세스의 규제 기능은 단백질 - 단백질 상호 작용의 형성 및 종료에 따라 달라집니다. 현미경 영상은 살아있는 세포에서 찬란 태그 단백질의 실시간 추적을 할 수 있습니다. 태그 단백질의 colocalization을이 단백질 사이의 직접 또는 간접적으로 상호 작용을 제안 할 수 있습니다, 그리고 면역 침전 등의 생화학 적 방법에 의해 얻어진 결과를 강화하는 데 사용할 수 있습니다. 생화학 적 방법과는 달리, 살아있는 세포 이미징이 간 단백질의 상호 작용이 발생할 때 생리적 인 과정의 모니터링을 촉진하고 단백질의 세포 분포의 검출, 공간적 및 시간에 관찰 할 수 있습니다. colocalization을의 정량 분석을위한 다양한 도구가 개발되었다; 피어슨의 상관 계수는 두 개의 단백질 12 사이 colocalization을 정도의 정량화를위한 아주 매력적이고 널리 사용되는 방법 남아 있습니다. 반면 형광 공명 전자에너 전송 (무서워) 실험 가까이 (10 NM)을 특징으로 간 단백질 상호 작용의 검출을.......
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공개 사항
우리는 공개 할 관심 없음 충돌이 없습니다.
감사의 글
저자는 기술 지원 소피아 튀김 감사합니다. 보조금 no.1659/08, 971 / 08, 1503년부터 1508년까지 및 10분의 491, 아니 보조금 보건 및 과학의 사역에 대한 이스라엘 과학 재단 : MBS는 자신의 연구 지원을 위해 다음과 같은 기관을 감사드립니다. 3-4114과 3-6540, 후반 알렉산더 Smidoda의 부동산을 통해 이스라엘 암 협회와 바이오 의약품의 우수성 부여에 대한 Taubenblatt 패밀리 재단.
....액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 시약/재료 | |||
| Amaxa 인간 T 세포 핵 펙터 키트 | Lonza | VCA-1002 | |
| Anti CD3 (UCHT1 클론) | BioLegend | 300432 | |
| Falcon FACS 튜브 | Becton Dickinson | 352058 | |
| FCS | HyClone | SV30160.03 | |
| G418 | Calbiochem | 345810 | |
| 독일 커버 글라스 시스템 4 챔버 슬라이드 | Lab-Tek II | 155382 | |
| HCl | Bio Lab | 8410501 | |
| Hepes | Biological Industries | 03-025-1B | |
| Hygomycin | Enzo | ALX-380-306 | |
| L-글루타민 | Sigma | G7513 | |
| PBS (10X) | Sigma | D1408 | |
| 페니실린-스트렙토마이신 | 시그마 | P0781 | |
| 폴리-L-라이신 0.1 % (w/v) in H2O | 시그마 | P8920 | |
| RPMI | 시그마 | R87589 | |
| 아지드화 나트륨 | 시그마 | S2002 | |
| Equipment | |||
| Accublock 디지털 드라이 배스 | Labnet | D1105A | |
| Centrifuge | Eppendorf | Centrifuge 5810 R | |
| 컨포칼 현미경 | Zeiss | LSM 510 Meta | |
| 가열식 장착 프레임 - 가열 인서트 P S | PeCon | 130-800-031 | |
| TempModule S (가열식 장착 프레임에 필요) | Zeiss | 411860-9010-000 | |
| 전기천공법 장치 | Amaxa | Nucleofector I | |
| 형광 활성 세포 분류기 | Becton Dickinson | FACSVantage SE | |
| 이미지 분석 소프트웨어 | Bitplane | 7.0.0 |
참고문헌
- Viret, C., Janeway, C. A. MHC and T cell development. Rev. Immunogenet. 1, 91-104 (1999).
- Risso, A. Leukocyte antimicrobial peptides: multifunctional effector molecules of innate immunity. J. Leukoc. Biol. 68, 785-792 (2000).
- Doherty, P. C.
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재인쇄 및 허가
