Astrocytes 정상 뇌 개발 및 기능, 및 중앙 신경계 수리를 위해 필수적인 기초 생물학적 과정에 참여하는 다양한 세포로 인정되었습니다. 여기 중추 신경계 세포의 주요 클래스의 생물학을 연구하는 순수 마우스 astrocyte 문화를 얻기 위해 빠른 절차를 제시한다.
이 콘텐츠를 보려면 JoVE 구독이 필요합니다. 로그인하거나 오늘 무료 평가판을 시작하세요.
이 논문에서
요약
초록
Astrocytes는 포유류의 뇌에 풍부한 세포 유형입니다, 아직 많은 자신의 분자와 기능 특성에 대해 학습 할 수 남아 있습니다. 체외 astrocyte 세포 배양 시스템에 자세히 이러한 glial 세포의 생물학적 기능을 연구하는 데 사용할 수 있습니다. 이 비디오 프로토콜은 마우스 새끼의 혼합 대뇌 피질 세포의 절연 및 문화 순수한 astrocytes를 얻는 방법을 보여줍니다. 방법은 가능한 뉴런의 부재와 astrocytes, oligodendrocytes 및 microglia, 문화의 중추 신경 시스템의 세 가지 주요 glial 세포 인구의 분리에 기반을두고 있습니다. 문화의 첫 번째 일 동안 대표 이미지가 혼합 셀 인구의 존재를 입증하고 astrocytes가 합류되고 microglia 및 oligodendrocytes에서 분리해야 할 때, timepoint을 나타냅니다. 또한, 우리는 순결하고 잘 설립을위한 immunocytochemical stainings를 사용하여 양식 astrocytes의 astrocytic 형태를 보여와새로 astrocyte 마커를 설명했다. 이 문화 시스템은 쉽게 astrocyte 생물학의 다양한 측면을 연구에 대한 순수한 마우스 astrocytes와 astrocyte이 설치된 미디어를 얻을하는 데 사용할 수 있습니다.
서론
Astrocytes는 중추 신경계 (CNS)의 매우 풍부한 세포 유형입니다. 인간의 대뇌 피질 1 뉴런 당 1.4 astrocytes가 반면 뉴런에 astrocytes의 비율은, 쥐와 쥐의 대뇌 피질에 1시 3분입니다. astrocyte 기능에 대한 관심은 최근 몇 년 동안 크게 증가했다. astrocytes의 주요 기능은 뉴런 2,3에 구조와 신진 대사 지원을 제공하는 역할입니다. astrocytes에 새로 발견 된 역할은 기능의 폭 넓은 스펙트럼을 커버. 이러한 개발 4-6 동안 개발 axons과 특정 neuroblasts의 마이그레이션 가이드, 신경 전달의 기능, 신경 회로 7-9으로 시냅스의 강도와 정보 처리, 혈액 - 뇌 장벽의 역할 (BBB)이 형성 10 무결성 11-13을 포함 뇌 혈관 톤 (14)과 규제. astrocytes의 또 다른 주요 기능은 부상에 대한 그들의 반응이다. 병적 인 조건 astrocyt 아래에스 반응이되고 더 중간 필라멘트 glial fibrillary 산성 단백질 (GFAP)와 억제 세포 외 기질 (ECM) 단백질 15,16의 표현을 upregulate. 반응 astrocytes은 콘드로이틴 황산 ....
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
프로토콜
1. 혼합 두피 세포의 분리 및 도금
astrocyte 문화를 혼합 대뇌 피질의 세포 고립 P4 마우스 새끼로 P1을 사용하여 수행 할 수 있습니다. 적절한 astrocyte 밀도를 달성하기 위해이 T75 조직 배양 플라스크에 4 마우스 새끼 cortices를 사용 할 필요가 있습니다. 따라서, 다음과 같은 프로토콜의 볼륨은 4 마우스 새끼를 사용하여 셀 준비를 위해 계산됩니다.
- 분해 절차를 시작하기 전에, astrocyte 문화 미디어 prewarm 30 ML (DMEM, 고 포도당 + 10 %의 열 inactivated 태아 소 혈청 + 1퍼센트 페니실린 / 스트렙토 마이신, 표 참조) 37 ° C. 37 번 1 시간을위한 세포 배양 등급 물에서 50 μg / ML의 농도 ° CO 2 인큐베이터에서 C의 폴리-D-리신 (PDL)의 20 ML과 문장 한 T75 플라스크입니다.
- 분해 절차에 대해 필요한 모든 시약 및 재료를 준비합니다. 당신이 필요합니다 : 수술 가위, 부드러운 고급 포셉, 평면 팁 포셉, 종이 수건, 폐기물 가방, 70 % 에탄올을얼음에 D이 해부 요리 (3.5 cm 직경은) 2 ML의 HBSS 각이 가득.
- 부드럽게 유지하고 70 %의 에탄올과 새....
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
결과
전체 마우스의 뇌 (그림 1A), 소뇌 및 후각 구근은 (그림 1B) 제거 할 필요가의 고립시. cortices은 마우스 뇌 줄기 (그림 1C) 및 개인 피질 (그림 1D ')의 meninges의 껍질을 벗겨 아르주의 (그림 1E) 제거됩니다. Meninges는 수막 동맥 시스템 및 수막 세포와 섬유 아세포에 의한 최종 astrocyte 문화의 오염의 불완전 제거 결과로 분명합니다.
혼합 대뇌 피질의 세포 현탁액의 도금 후, 일부 astrocytes는 이미 24 시간 (그림 2A)에서 문화 플라스크에 첨부합니다. 문화 매체가 glial 세포의 생존과 성장을 중시하는 그러나, 세포 배양 표면에 뜨는는, 첫 번째 3-5일 (그림 2A-C)에 대한 세포 파편과 죽어.......
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
토론
여기에 설명 된 방법은 원래 1980 27 맥카시와 드 Vellis에 의해 설명 쥐 신생아 뇌에서 astrocyte 문화 준비에 기반을두고 있습니다. 출생 후의 P1에서 P4 마우스 뇌 피질 astrocytes의 고립과 문화의 수정 방법은 여기에 제시된 것은 수율 순수 기본 astrocytes 빠르고 높은 재현합니다. 이 기술은 쉽게 이러한 쥐 또는 돼지에서와 같은 척수와 같은 다른 뇌 영역에서 같은 다른 종에서 astrocytes을 분리 양도 할 수 있습니다. 맥카시와 deVellis 방법에 의한 신생아 뇌에서 astrocyte 전구 세포 절연이 높은 proliferative 세포를 생성하는 반면, 세포 증식 및 출생 후의 P1-P4 마우스 새끼의 분리 astrocytes의 전파가 제한됩니다. 분할 astrocytes 한 번 체외 7 일에 (DIV), 그들이 성장 후 confluency과 성숙. 생체에서 대부분의 astrocyte 확산 P14 32로 크게.......
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
공개 사항
관심 없음 충돌이 선언 없습니다.
감사의 글
SS, 킬로바이트 및 유럽위원회 (European Commission) FP7 부여 PIRG08-GA-2010-276989, NEUREX에 교육과 연구의 연방 교육부 (BMBF 01 EO 0803), 및 / 독일 연구 재단 기금 SCHA 1442에 Fazit 재단 대학원 친목에 의해 지원 CS에 3-1 저자는 충돌 재정 이익이 없습니다.
....액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 작업 솔루션의 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 최종 농도 |
| Astrocyte 문화 미디어 | |||
| DMEM, 높은 혈당 | 생명 기술 | 31966-021 | |
| 열 inactivated FBS, | 생명 기술 | 10082-147 | 최종 농도 : 10 % |
| 페니실린 - 스트렙토 마이신 | 생명 기술 | 15140-122 | 최종 농도 : 1 % |
| 뇌 세포 발굴을위한 솔루션estion | |||
| HBSS | 생명 기술 | 14170-088 | |
| 2.5 %의 트립신 | 생명 기술 | 15090-046 | 최종 농도 : 0.25 % |
| 다른 | |||
| 70 % (권 / 권) 에탄올 | 로스 | 9065.2 | |
| 폴리-D-라이신 | Millipore | A-003-E | 50 μg / ML |
| 물 | PAA | S15-012 | 세포 배양 등급 |
| PBS | PAA | H15-002 | 세포 배양 등급 |
| 0.05 %가보세요psin-EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) | 생명 기술 | 25300-062 | |
| 0.45 μm 무균 필터 | Sartorius | 16,555 | |
| 3.5 cm 페트리 접시 | BD 팔콘 | 353001 | |
| 15 ML 팔콘 튜브 | BD 팔콘 | 352096 | |
| 50 ML 팔콘 튜브 | BD 팔콘 | 352070 | |
| 75cm 두 조직 문화 플라스크 | BD 팔콘 | 353136 | |
| 집게, 괜찮아 | 뒤몽 | 2-1032, 2-1033 | # 3C, # 5 |
| 집게, 평면 팁 | KLS 마틴 | 12-120-11 | |
| 13cm 외과 가위 | Aesculap | BC-140-R | |
| Stereomicroscope | Leica | MZ7.5 | |
| Stereomicroscope + 카메라 | Leica | MZ16F, DFC320 | |
| 현미경 + 카메라 | Zeiss, 캐논 | 프리모 초록, 파워의 A650입니다 | |
| 원심 분리기 | Eppendorf | 5805000.017 | Centrifuge5804R |
| 궤도 쉐이커 | 열 과학 | SHKE 4450 - 1CE | MaxQ 4450 |
| 열탕 목욕 | Julabo | 에스W20, 37 ° C |
참고문헌
- Nedergaard, M., Ransom, B., Goldman, S. A. New roles for astrocytes: redefining the functional architecture of the brain. Trends Neurosci. 26, 523-530 (2003).
- Belanger, M., Allaman, I., Magistretti, P. J. Brain energy metabolism: focus on astrocyte-neuron metabol....
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재인쇄 및 허가
