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방법 논문

마우스 두피 Astrocytes의 분리와 문화

94.7K 조회수

⸱

DOI:

10.3791/50079

⸱

2013년 1월 19일

 ,  ,  , 
1Institute of Anatomy and Cell Biology, University of Freiburg , 2Centre of Chronic Immunodeficiency (CCI), University Medical Centre Freiburg, University of Freiburg

이 논문에서

요약

Astrocytes 정상 뇌 개발 및 기능, 및 중앙 신경계 수리를 위해 필수적인 기초 생물학적 과정에 참여하는 다양한 세포로 인정되었습니다. 여기 중추 신경계 세포의 주요 클래스의 생물학을 연구하는 순수 마우스 astrocyte 문화를 얻기 위해 빠른 절차를 제시한다.

초록

Astrocytes는 포유류의 뇌에 풍부한 세포 유형입니다, 아직 많은 자신의 분자와 기능 특성에 대해 학습 할 수 남아 있습니다. 체외 astrocyte 세포 배양 시스템에 자세히 이러한 glial 세포의 생물학적 기능을 연구하는 데 사용할 수 있습니다. 이 비디오 프로토콜은 마우스 새끼의 혼합 대뇌 피질 세포의 절연 및 문화 순수한 astrocytes를 얻는 방법을 보여줍니다. 방법은 가능한 뉴런의 부재와 astrocytes, oligodendrocytes 및 microglia, 문화의 중추 신경 시스템의 세 가지 주요 glial 세포 인구의 분리에 기반을두고 있습니다. 문화의 첫 번째 일 동안 대표 이미지가 혼합 셀 인구의 존재를 입증하고 astrocytes가 합류되고 microglia 및 oligodendrocytes에서 분리해야 할 때, timepoint을 나타냅니다. 또한, 우리는 순결하고 잘 설립을위한 immunocytochemical stainings를 사용하여 양식 astrocytes의 astrocytic 형태를 보여와새로 astrocyte 마커를 설명했다. 이 문화 시스템은 쉽게 astrocyte 생물학의 다양한 측면을 연구에 대한 순수한 마우스 astrocytes와 astrocyte이 설치된 미디어를 얻을하는 데 사용할 수 있습니다.

서론

Astrocytes는 중추 신경계 (CNS)의 매우 풍부한 세포 유형입니다. 인간의 대뇌 피질 1 뉴런 당 1.4 astrocytes가 반면 뉴런에 astrocytes의 비율은, 쥐와 쥐의 대뇌 피질에 1시 3분입니다. astrocyte 기능에 대한 관심은 최근 몇 년 동안 크게 증가했다. astrocytes의 주요 기능은 뉴런 2,3에 구조와 신진 대사 지원을 제공하는 역할입니다. astrocytes에 새로 발견 된 역할은 기능의 폭 넓은 스펙트럼을 커버. 이러한 개발 4-6 동안 개발 axons과 특정 neuroblasts의 마이그레이션 가이드, 신경 전달의 기능, 신경 회로 7-9으로 시냅스의 강도와 정보 처리, 혈액 - 뇌 장벽의 역할 (BBB)이 형성 10 무결성 11-13을 포함 뇌 혈관 톤 (14)과 규제. astrocytes의 또 다른 주요 기능은 부상에 대한 그들의 반응이다. 병적 인 조건 astrocyt 아래에스 반응이되고 더 중간 필라멘트 glial fibrillary 산성 단백질 (GFAP)와 억제 세포 외 기질 (ECM) 단백질 15,16의 표현을 upregulate. 반응 astrocytes은 콘드로이틴 황산 proteoglycan (CSPG) 가족의 astrocyte 분비 ECM 단백질의 주요 구성 glial 흉터를 형성하여 건강한 조직에서 부상 사이트를 한계를 정하다, 그 주요 요인은 CNS 손상 15-17 후 axonal 재생을 억제.

Astrocytes 늦게 embryogenesis과 이른 출생 후의 생활 동안 레이디 얼 glial (RG) 세포에서 발생. astrocyte 사양가 발생했습니다 후 astrocyte 전구체는 최종 위치로 이전, 그들이 터미널 차별화의 과정을 어디서부터 시작. 생체에서 astrocytes는 전형적인 형태 18,19로 표시로 3-4주 출생 후 성인 것 같습니다. RG 세포의 subpopulation은 subventricular 영역 astrocytes (타입 B 세포)로 변환합니다. Both, RG 입력합니다 B 세포는 각각 개발 중에 있으며 성인의 astrocyte 같은 신경 줄기 세포 (NSCs)로 기능을 수행합니다. astrocytes, RG 입력합니다 B 세포와 마찬가지로 또한이 마커가 독점적으로 특별히 성인 astrocytes 라벨을 사용할 수 없습니다 나타냅니다 astrocyte 특정 glutamate의 전송 (GLAST), 뇌 지질 결합 단백질 (BLBP) 및 GFAP를 표현한다. 건강한 뇌, RG 및 자기 갱신에 대한 용량과 같은 타입 B 세포 전시 줄기 세포의 잠재력에 나누어하지 않는 성인 parenchymal astrocytes에 대비합니다. astrocytes의 Dysregulation는 알츠하이머 병 20,21, 헌팅턴 병 22, 파킨슨 병 23, Rett 증후군 24 알렉산더 병 25를 포함하여 많은 pathologies에 연루되었습니다. 또한, astrocytes는 astrocyte 활성화 및 astrocytic glial 흉터 형성 16,26로 이어지는, CNS의 모든 모욕에 반응. 다음 뇌 TR을 형성 astrocytic glial 흉터auma 또는 척수의 부상은 neuronal 재생 15을 방지하는 소수의 장벽이 될 것으로 생각됩니다.

세포의 정화 인구를 분리하고 유지하기 위해 신뢰할 수있는 방법의 개발은 신경​​계에 대한 우리의 이해에 필수적이었습니다. 맥카시와 드 Vellis의 개척 작업은 신생아 쥐 조직 27 일부터 astrocytes의 거의 순수한 문화를 준비하는 날짜로 조사 할 수 있습니다. 대부분 마우스 대뇌 피질의 astrocytes를 격리시킨 것에 대한 약간 수정 형태로 여기에 제공됩니다이 방법을 사용 astrocyte 생물학에 대해 알게되었습니다. 생체 연구, astrocytes뿐만 아니라 설치된 매체가 얻은 체외 문화에 설명을 사용하여 보완, 추가 astrocyte 함수로 정보를 얻으려면 유용한 도구입니다.

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프로토콜

1. 혼합 두피 세포의 분리 및 도금

astrocyte 문화를 혼합 대뇌 피질의 세포 고립 P4 마우스 새끼로 P1을 사용하여 수행 할 수 있습니다. 적절한 astrocyte 밀도를 달성하기 위해이 T75 조직 배양 플라스크에 4 마우스 새끼 cortices를 사용 할 필요가 있습니다. 따라서, 다음과 같은 프로토콜의 볼륨은 4 마우스 새끼를 사용하여 셀 준비를 위해 계산됩니다.

  1. 분해 절차를 시작하기 전에, astrocyte 문화 미디어 prewarm 30 ML (DMEM, 고 포도당 + 10 %의 열 inactivated 태아 소 혈청 + 1퍼센트 페니실린 / 스트렙토 마이신, 표 참조) 37 ° C. 37 번 1 시간을위한 세포 배양 등급 물에서 50 μg / ML의 농도 ° CO 2 인큐베이터에서 C의 폴리-D-리신 (PDL)의 20 ML과 문장 한 T75 플라스크입니다.
  2. 분해 절차에 대해 필요한 모든 시약 및 재료를 준비합니다. 당신이 필요합니다 : 수술 가위, 부드러운 고급 포셉, 평면 팁 포셉, 종이 수건, 폐기물 가방, 70 % 에탄올을얼음에 D이 해부 요리 (3.5 cm 직경은) 2 ML의 HBSS 각이 가득.
  3. 부드럽게 유지하고 70 %의 에탄올과 새끼 쥐의 머리와 목을 스프레이. 동물은 가위를 사용하여 목 베기에 의해 희생된다.
  4. 두개골을 표시하는 방법으로 두피를 따라 앞쪽으로 뒤쪽 중간 선 절개를, 수행합니다.
  5. 목에서 코주의 깊게 두개골을 잘라 요. 두 개의 추가 삭감은 뇌에 더 액세스 할 수 있도록 수행됩니다 : 첫 번째 컷은 후각 전구, 두개골 바닥에서 두개골을 분리 할 수​​있는 소뇌의 하부 다른 하나의 앞쪽에 구성되어 있습니다.
  6. 평면 팁 집게를 사용하여 두개의 날개가 부드럽게 옆에 이성을 상실하고 뇌는 HBSS로 가득 첫 해부 접시에 제거하고 배치됩니다. 얼음에 다시 접시를 놓고 모든 4 뇌를 수확 계속 진행합니다.
  7. 분해 절차의 나머지 부분은 stereomicroscope에서 수행됩니다. 첫째, 후각 전구와 소뇌는 고급을 사용하여 제거해부 포셉 (그림 1B).
  8. , cortices을 검색 고급 집게와 뇌의 뒤쪽 끝을 잡아하기 위해, 반구 사이의 중간 선 절개을 수행 생성 된 숲에 포셉의 두 번째 세트를 삽입하고 벗겨 버릴에서 피질의 판과 같은 구조 뇌.
  9. 조심스럽게 고급 집게 (그림 1D ')로 당겨 피질의 뇌에서 meninges를 해부. 이 단계는 수막 세포와 섬유 아세포에 의한 최종 astrocyte 문화의 오염을 방지합니다. HBSS로 가득 두 번째 접시에 준비한 피질의 뇌를 전송하고 얼음으로 그것을 반환합니다. 모든 4 cortices에 따라 계속합니다.
  10. 마지막으로, 날카로운 블레이드를 (약 4 8 배)를 사용하여 작은 조각으로 각 피질 반구를 잘라.
  11. 무균 조건 하에서, 전송 피질하다 50 ML 팔콘 튜브에 조각과 22.5 ML의 총 볼륨에 HBSS를 추가합니다.
  12. 2.5 %의 트립신, 혼합 2.5 ML를 추가하고 품다37 번 물 목욕의 조직 ° C 30 분에. 매 10 분을 흔들어 가끔하여 섞는다.
  13. 펠렛 피질 조직 조각 300 XG에서 5 분 동안 원심 분리기.
  14. 조심스럽게 decantation에 의해 표면에 뜨는 제거합니다. 조직 펠렛을 잃지 않도록하기 위해 당신은 기계적으로는 pipet을 사용하여 유지 될 수 있습니다. 조직 조각이 하나의 세포 (20-30 회)에 dissociated 때까지 10 ML 플라스틱 피펫을 사용하여 10 ML astrocyte 도금 매체와 적극적으로 pipetting을 추가하여 단​​일 세포 현탁액으로 조직을 떼어 놓다. astrocyte 도금 매체를 사용하여 20 ML에 볼륨을 조정합니다. 당신은 hematocytometer를 사용하여 계산하여 단일 세포로 증명 피질 조직의 분리를 할 수 있습니다. 4 마우스 새끼 cortices 중 하나 준비 10-15 X10 6 dissociated 하나의 세포를 얻을 수 있습니다.
  15. T75 문화 플라스크에서 PDL를 대기음, 판 37 번 dissociated 단일 세포 현탁액 및 배양 ° CO 2 인큐베이터에서 C.

2. Enr 구하기iched Astrocyte 문화

  1. 이후 혼합 대뇌 피질의 세포 및 모든 3 일 도금 후 매체 2 일 변경합니다.
  2. astrocytes가 합류하고 오버레이 microglia하는 astrocyte 레이어에 노출 앉거나 이미 astrocyte 레이어 (그림 2)에서 떨어 뜨려 7~8일, 후, microglia를 제거 할 수 궤도 셰이커 30 분 동안 180 rpm으로 T75 플라스크를 흔들. 표면에 뜨는 포함 microglia를 삭제 하시겠습니까이나 문화에 희망과 microglia를 검토하는 경우를 스핀 다운과 문화 28,29위한 판.
  3. 20 ML 신선한 astrocyte 문화 매체를 추가하고 oligodendrocyte 전구체 세포 (OPC)를 제거하기 위해 6 시간에 240 rpm으로 술병을 흔들어하여 계속 진행합니다. 일부 OPCs 완전히 astrocyte 레이어에서 분리되지 않습니다 때문에, OPC 오염을 방지하기 위해 1 분에 손으로 힘차게 흔들하고 있습니다. 표면에 뜨는을 취소하거나 문화에 OPCs 29 원하는 경우, 내려와 플레이트 스핀.
  4. 나머지 conflue을 씻어PBS로 두 번 NT astrocyte 층은, 37의 CO 2 인큐베이터에서 5 ML 트립신 - EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) 및 배양을 추가 ° C., PBS를 대기음 astrocytes의 분리마다 5 분을 확인하고 손 (2-3 번)의 손바닥에 대해 플라스크를 클릭하여 astrocytes의 부대를 시행합니다.
  5. astrocytes는 문화 플라스크에서 분리 된 후, astrocyte 문화 매체, 5 분 180 XG에서 스핀 세포의 5 ML을 추가 표면에 뜨는을 대기음 40 ML 신선한 astrocyte 도금 매체를 추가 할 수 있습니다. 한 T75 조직 배양 플라스크는 첫 번째 셀 분할 후 6 1x10 주변의 세포를 얻을 수 있습니다. 37 두 개의 T75 문화 플라스크 및 배양에 판 세포 ° CO 2 인큐베이터에서 C. 모든 2~3일 매체를 변경합니다.
  6. 첫 번째 분할 astrocytes 후 12-14일는 실험을 수행하기 전에 해당 셀 농도 24-48 시간에 도금되어 있습니다. 한 T75 조직 배양 플라스크는 두 번째 셀 분할 후 1.5-2 주변 X10 6 세포를 얻을 수 있습니다.

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결과

전체 마우스의 뇌 (그림 1A), 소뇌 및 후각 구근은 (그림 1B) 제거 할 필요가의 고립시. cortices은 마우스 뇌 줄기 (그림 1C) 및 개인 피질 (그림 1D ')의 meninges의 껍질을 벗겨 아르주의 (그림 1E) 제거됩니다. Meninges는 수막 동맥 시스템 및 수막 세포와 섬유 아세포에 의한 최종 astrocyte 문화의 오염의 불완전 제거 결과로 분명합니다.

혼합 대뇌 피질의 세포 현탁액의 도금 후, 일부 astrocytes는 이미 24 시간 (그림 2A)에서 문화 플라스크에 첨부합니다. 문화 매체가 glial 세포의 생존과 성장을 중시하는 그러나, 세포 배양 표면에 뜨는는, 첫 번째 3-5일 (그림 2A-C)에 대한 세포 파편과 죽어...

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토론

여기에 설명 된 방법은 원래 1980 27 맥카시와 드 Vellis에 의해 설명 쥐 신생아 뇌에서 astrocyte 문화 준비에 기반을두고 있습니다. 출생 후의 P1에서 P4 마우스 뇌 피질 astrocytes의 고립과 문화의 수정 방법은 여기에 제시된 것은 수율 순수 기본 astrocytes 빠르고 높은 재현합니다. 이 기술은 쉽게 이러한 쥐 또는 돼지에서와 같은 척수와 같은 다른 뇌 영역에서 같은 다른 종에서 astrocytes을 분리 양도 할 수 있습니다. 맥카시와 deVellis 방법에 의한 신생아 뇌에서 astrocyte 전구 세포 절연이 높은 proliferative 세포를 생성하는 반면, 세포 증식 및 출생 후의 P1-P4 마우스 새끼의 분리 astrocytes의 전파가 제한됩니다. 분할 astrocytes 한 번 체외 7 일에 (DIV), 그들이 성장 후 confluency과 성숙. 생체에서 대부분의 astrocyte 확산 P14 32로 크게...

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공개 사항

관심 없음 충돌이 선언 없습니다.

감사의 글

SS, 킬로바이트 및 유럽위원회 (European Commission) FP7 부여 PIRG08-GA-2010-276989, NEUREX에 교육과 연구의 연방 교육부 (BMBF 01 EO 0803), 및 / 독일 연구 재단 기금 SCHA 1442에 Fazit 재단 대학원 친목에 의해 지원 CS에 3-1 저자는 충돌 재정 이익이 없습니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
작업 솔루션의 이름 회사 카탈로그 번호 최종 농도
Astrocyte 문화 미디어
DMEM, 높은 혈당 생명 기술 31966-021
열 inactivated FBS, 생명 기술 10082-1​​47 최종 농도 : 10 %
페니실린 - 스트렙토 마이신 생명 기술 15140-122 최종 농도 : 1 %
뇌 세포 발굴을위한 솔루션estion
HBSS 생명 기술 14170-088
2.5 %의 트립신 생명 기술 15090-046 최종 농도 : 0.25 %
다른
70 % (권 / 권) 에탄올 로스 9065.2
폴리-D-라이신 Millipore A-003-E 50 μg / ML
물 PAA S15-012 세포 배양 등급
PBS PAA H15-002 세포 배양 등급
0.05 %가보세요psin-EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) 생명 기술 25300-062
0.45 μm 무균 필터 Sartorius 16,555
3.5 cm 페트리 접시 BD 팔콘 353001
15 ML 팔콘 튜브 BD 팔콘 352096
50 ML 팔콘 튜브 BD 팔콘 352070
75cm 두 조직 문화 플라스크 BD 팔콘 353136
집게, 괜찮아 뒤몽 2-1032, 2-1033 # 3C, # 5
집게, 평면 팁 KLS 마틴 12-120-11
13cm 외과 가위 Aesculap BC-140-R
Stereomicroscope Leica MZ7.5
Stereomicroscope + 카메라 Leica MZ16F, DFC320
현미경 + 카메라 Zeiss, 캐논 프리모 초록, 파워의 A650입니다
원심 분리기 Eppendorf 5805000.017 Centrifuge5804R
궤도 쉐이커 열 과학 SHKE 4450 - 1CE MaxQ 4450
열탕 목욕 Julabo 에스W20, 37 ° C

참고문헌

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