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방법 논문

시스테인 잔류 물을 용매 접근성에 대한 분석

10.5K 조회수

⸱

DOI:

10.3791/50084

⸱

2013년 2월 14일

 , 
1Plant Sciences Institute, Agricultural Research Service, United States Department of Agriculture, 2Molecular Plant Pathology Laboratory, Agricultural Research Service, United States Department of Agriculture

이 논문에서

요약

의 시스테인 잔류의 thiol 그룹의 용매 접근성을 분석하는 방법 옥수수 rayado fino 바이러스 (MRFV) 바이러스 같은 입자 (VLPs)이 설명되어 있습니다. 방법은 특정 반응에 타겟이 될 수있는 VLPs의 표면에 여러 화학 그룹의 가용성을 활용합니다.

초록

바이러스 속성과 물리 및 물리적 특성을 모방하고 활용하는 것은 세계에서 가장 급박 한 문제 중 일부에 대한 해결책을 제공 할 약속을 보유하고 있습니다. 깎아 지른듯한 범위와 자신의 흥미 특성과 결합 바이러스의 종류는 잠재적으로 바이러스 기반 기술의 응용 프로그램 끊임없는 기회를 제공합니다. 바이러스는 온도와 pH의 조건의 다양한 미만의 이산 모양과 크기, 대칭의 특이성, polyvalence, 안정적인 특성을 가진 입자로 자기 조립 할 수있는 능력을 갖추고 있습니다. 당연히, 속성의 이러한 놀라운 범위, 바이러스는 biomaterials 9, 백신 14, 15, 전자 재료, 화학 도구 및 분자 전자 컨테이너 4, 5, 10, 11, 16, 18, ​​12에 사용하기 위해 제안합니다.

나노 기술에 바이러스를 이용하기 위해, 그들은 새로운 기능을 가르친다하기 위해 자연적인 형태에서 수정해야합니다. 이 도전 홍보ocess는 유전 바이러스 게놈의 수정 및 화학적으로 바이러스 입자 반응 그룹 8 외국인 또는 원하는 분자를 부착 등 여러 가지 메커니즘을 통해 수행 할 수 있습니다. 바이러스를 수정하는 기능은 주로 바이러스의 physiochemical과 물리적 특성에 따라 달라집니다. 또한, 유전자 또는 physiochemical 수정에 나쁜 바이러스 기본 구조 및 바이러스 기능에 영향을주지 않고 수행해야합니다. 옥수수 rayado fino 바이러스 (MRFV) 코트 단백질은 단백질 단백질에 의해 안정화 아르 안정적이고 빈 VLPs을 생산 대장균에 자기 조립 상호 작용하고는 바이러스 기반 기술 응용 프로그램 8에서 사용할 수 있습니다. 담배 공장에서 생산 VLPs는 펩티드의 다양한 종류의 covalently 13 표시 할 수있는 발판으로 조사되었다. 여기, 우리는 바이러스 capsid에있는 용매의 접근이 cysteine​​s 어떤이 modifi 사용할 수 있습니다 결정) 1 단계를 설명양이온, 그리고 2) 수정 capsids에 펩티드를 bioconjugate. 네이티브 또는 mutationally - 삽입 아미노산 잔류 물 및 표준 커플 링 기술을 사용하여 재료의 다양한 종류 등 Brome 모자이크 바이러스 3, 카네이션의 반점 바이러스 12 Cowpea chlorotic 반점 바이러스 6, 담배 모자이크와 같은 식물 바이러스의 표면에 표시되어 바이러스 17, 순무 대가리 노란색 모자이크 바이러스 1, MRFV 13.

프로토콜

1. Nicotiana benthamiana 식물에서 바이러스 접종과 VLPs 정화

  1. 감자 바이러스 X (PVX) 기반 들고 벡터 plasmids의 상한선 T7-RNA 기록을 생산 MRFV 야생 타입 (중량) 및 Cys-변이 코트 단백질 (CP) 유전자 12 Ambion의 T7-mMessage mMachine 키트를 사용합니다.
  2. 각 T7의 성적 반응의 경우, N.의 두 완전히 확장 잎의 예방 10 μl 반응과 25에서 빛 (25,000-30,000 룩스) 16 시간 60 %의 습도에서 온실에서 10 일 동안 식물을 길러 benthamiana 20 ° C과 어두운 8 시간 ° C.
  3. Harves t N. benthamiana 바이러스에 감염된 잎 10 일 후 접종 (DPI)는 얼음에 식물 조직 (50g)와 장소를 무게.
  4. 0.5 M 오세영 - 구연산 버퍼, pH를 5.5 (사용이 식물 조직 g 당 버퍼의 ML)의 차가운 솔루션의 100 ML의 존재에 믹서기에서 식물 자료를 균질화.
  5. cheesecl 3 층을 통해 homogenate를 필터링oth 30 분에 27,000 XG에서 원심 분리하여 명확히. 차가운 졸업 실린더로 표면에 뜨는을 전송, 볼륨을 측정하고 차가운 멸균 비이커에 전송할 수 있습니다. 펠렛을 폐기하십시오.
  6. 4 ° C에서 15 분 동안 저어, 10 % 폴리에틸렌 글리콜 8 천 (PEG 8,000)를 추가하여 표면에 뜨는을 처리, 4에서 추가 45 분에 품다 ° C 바이러스 같은 입자 (VLPs) PEG 행렬을 침전 할 수 있습니다.
  7. 4 ° C에서 20 분에 27,000 XG에서 샘플을 원심 분리기하고 표면에 뜨는을 제거합니다.
  8. 0.05 M 오세영 - 구연산 버퍼, 5.5 2 % 포함 튼 X-100 산도 8 ML을 추가하여 펠렛을 처리합니다. 소용돌이 원심 분리기 튜브는 잘 펠릿을 해제합니다. 차가운 멸균 비커에 펠렛과 버퍼를 전송합니다. 같은 버퍼 2 ML 즉시 튜브를 씻어 비커에 추가 할 수 있습니다. 펠릿은 (일반적으로 1 시간) 용해 아르 ° C까지 4에 정지 저어.
  9. 27,000 XG에서 5 분 동안 원심 분리하여 명확히, 펠렛을 버리고, 및 P4의 2 시간에 140,000 XG에서 원심 분리하여 rocess는 표면에 뜨는 ° C.
  10. 한 ML 0.05 M 오세영 - 구연산 버퍼, 산도 5.5에서 펠렛을 Resuspend하고 0.05 M 오세영 - 구연산 버퍼, 산도 5.5에서 만든 10-40%의 자당 기울기 위의 정지를 놓습니다.
  11. 4에 140,000 XG에 3 시간의 기울기를 원심 분리기 ° C.
  12. 원심 분리기 튜브의 상단을 통해 빛을 밝히고 튜브의 상단에서 4cm의 광 산란 상단 밴드를 수집, 4에서 140,000 XG에서 3 시간에 0.05 M 오세영 - 구연산 버퍼, 산도 5.5 및 원심 분리기로 희석 ° C.
  13. 최대 6 개월까지에 대해 4 ° C에서 멸균 물과 매장의 0.5 ML에서 펠렛을 Resuspend.
  14. 브래드 포드 단백질 분석을 수행하여 VLPs 농도를 Quantitate. VLPs의 수율은 식물 조직의 1 ~ 3 μg / g입니다.

2. VLPs의 Fluorescein-5-maleimide-라벨 반응

  1. 50 MM 나트륨 phosphat에 fluorescein-5-maleimide (427.37 g / 사마귀)의 1 ㎜ 솔루션을 준비전자 버퍼, 산도 7.0, 1 MM EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산). 소용돌이를 사용하여 혼합하고 완전한 해산을 확인합니다. 알루미늄 호일을 사용하여 빛으로부터 관을 보호합니다.
  2. 단계 1과 믹스에서 생산 VLPs에 fluorescein-5-maleimide을 추가합니다. sulfhydryls의 몰 금액에 대한 fluorescein-5-maleimide의 25 배를 초과 몰을 사용합니다. 일반적으로, 1 μg / μl과 fluorescein-5-maleimide 솔루션 60 μl의 농도에 VLPs의 30 μl를 사용하여 허용 결과를 생산하고 있습니다.
  3. 4 ° C.에서 상온이나 야간 2 시간의 반응을 품다
  4. 50 mm의 최종 농도에 dithiothreitol (DTT)를 추가하여 반응을 종료 할 수 있습니다.
  5. 제거되지 않은 반응 상온에서 1,500 XG에서 2 분을위한 탈염 스핀 컬럼 (열 과학 Inc의, 록 포드 IL)과 원심 분리를 사용하여 fluorescein.
  6. SDS-PAGE 분석은 각 반응의 10 μl로 2 X SDS-PAGE Laemmli 샘플 버퍼 10 μl를 추가합니다. 포기 개월에 대해 4 ° C에서 빛으로부터 보호 표시된 단백질을 저장최대 3 개월까지 -20 ° C에서 단일 사용 aliquots 인치

3. 비오틴의 설립의 반응과 결정에 라벨 지정

  1. 물에서 인산염 버퍼 생리 (PBS) 1 단계에서 생산 VLPs의 산도 7.0에 버퍼 교환을 수행하는 탈염 스핀 열을 (열 과학 주식회사, 록 포드 IL)을 사용합니다.
  2. 아래로 pipetting과에 의해 maleimide-PEG2 - 비오틴과 혼합 없음 - 체중에 PBS의 190 μl를 추가하여 maleimide-PEG2 - 비오틴의 20 MM 주식 솔루션을 준비합니다.
  3. VLPs 및 혼합에 maleimide-PEG2 - 비오틴을 추가합니다. VLPs 솔루션을 시약의 10 배 어금니 초과를 사용 ≤ 2 밀리그램 / ML.
  4. 4 시간 동안 실온에서 반응을 품다.
  5. 제거되지 않은 반응 상온에서 1,500 XG에서 2 분을위한 탈염 스핀 컬럼 (열 과학 Inc의, 록 포드 IL)과 원심 분리를 사용하여 maleimide-PEG2 - 비오틴합니다.
  6. 피어스 비오틴 Quantitation 키트 (열 과학)과 구경을 사용하여 VLPs의 첩자 당 비오틴의 첩자를 결정제조업체의 지시 사항을 llowing.

4. Cys 2 VLPs와 F 펩타이드의 상호 연결

  1. 2 단계 (Cys 2 VLPs)에 교차 연결에 사용할 수 시스테인 잔류 물이 발생 VLPs는 다음 단계에 사용됩니다. 디메틸 sulfoxide의 680 μl에 NHS-PEG4-maleimide의 가교제의 10 밀리그램을 용해하여 신선한 간 연결 재고 솔루션 (28.63 MM)를 준비합니다.
  2. 17 (F)를 분해 - 아미노 활용 버퍼 50 μl (1 개 PBS, pH를 7.2, 1 MM EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산))에서 산 긴 펩타이드 (LLPNMOKDKEACAKAPL) 0.1 mm의 농도에.
  3. 1 ㎜ 최종 농도 (이는 펩타이드 솔루션의 0.1 MM의 10 배를 초과 몰입니다)에 용해 된 펩타이드 (단백질 NH2)의 50 μl에 가교제 4 μl를 추가합니다.
  4. 4 ° C.에서 2 시간의 반응을 품다
  5. 1500 XG에서 원심 분리하여, 활용 버퍼 (1 MM EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) 1 개 PBS, pH를 7.2)와 equilibrated 탈염 열 (열 과학 주식회사, 록 포드 IL)를 사용하여 교차 연결된 펩타이드를 정화상온에서 1 분에.
  6. VLPs (단백질 SH) 및 반응과 VLPs과 펩타이드 사이의 분자량의 차이에 참여 thiols와 활성 아민의 수에 의해 결정 몰 비율로 교차 연결된 펩티드 (단백질 NH2)를 결합 반응 믹스를 설정합니다.
  7. 4 ° C.에서 2 시간 동안 실온에서 반응 혼합물을 품다
  8. 서양 얼룩 분석을 위해, Laemmli 버퍼, 10 분에 종기가있는 결과로 복합 제품 1:1 혼합 10~20% 트리스 - 글리신 젤 (Invitrogen) 미리 캐스트에 SDS-PAGE를 수행에 electroblotting 다음 니트로 셀룰로스 막 (Invitrogen). 1 개 PBS, pH를 7.2이 0.05 % 십대 초반 - 2​​0 (PBS-십대 초반)와 적절한 인산 가수 분해 효소 - 라벨 차 항체에 이어 펩타이드 특정 항체와 5% 탈지 분유와 프로브를 포함하는으로 세포막을 차단합니다.

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결과

N.의 돌연변이 MRFV 코트 단백질 (CP) 유전자의 일시적 표현 PVX 기반의 벡터 생산 VLPs의 benthamiana 공장은 그림 1에 설명되어 있습니다. 수정 MRFV 코트 단백질 유전자는 PVX 기반 벡터, pP2C2S 2, (D. Baulcombe, 세 인스 베리 연구소, 노리치, 영국의 선물)에서 중복 subgenomic의 CP 프로모터의 전사 제어 PCR에 의해 증폭 한 후 배치됩니다.에서가 체외 RNA 전사는 N.을 예방하는 데 사용되는 RNA 기록을 생산 benthamiana 식물. 감염된 식물에서 (그림 2A) MRFV-CP의 subunits 쉽게 정화 아르 VLPs (그림 2B)을 형성하고 있습니다. 그 후, VLPs은 펩티드로 상호 연결되어 있습니다.

MRFV 코...

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토론

여기에 제시된 방법은 공장 제작 VLPs의 표면에뿐만 아니라 다른 단백질 단지에 존재 반응 cysteine​​s 매우 민감하고 빠른 분석이 가능합니다. Maleimides 안정적인 thioether 채권을 형성하기 위해 무료로 설프 하이 드릴 함유 분자와 반응하여 thiol 특정 시약입니다. 이 방법은 다른 아미노산과 상호 작용에 관여하지 설프 하이 드릴 그룹과 반응 할 수있는 maleimides의 특이성에 그립니다. VLPs의 기본 구조를 유지하는 것은 전체 과정을 매우 중요합니다. 설명 응용 프로그램에서 반응이 VLPs의 기본 구조를 유지하기 위해 네이티브 조건과 산도 7시 수행됩니다. 중성 산도에서 maleimides은 무료 설프 하이 드릴 그룹과 최적의 반응성을 갖추고 있습니다. 이 수정에 액세스 시스테인에 fluorescein 또는 비오틴 둘을 VLPs의 라벨 수 있습니다.

가벼운 산도 (6.5-7.5)와 버퍼 조건은 또한 상호 연결에 고용반응. VLPs에서 기능 그...

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공개 사항

간행물의 상용 제품의 상표 이름의 언급은 특정 정보를 제공 할 목적으로 만 있으며, 농업의 미국 부에 의해 추천이나 승인을 의미하지 않습니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
시약의 이름 회사 카탈로그 번호 코멘트
Thinwall, 울트라 클리어 튜브 Beckman 344059
mMESSAGE mMACHINE T7 키트 생활 Tecnologies AM1344M
Fluorescein-5-Maleimide 온도 과학 생활 기술 46,130 F150 46130은 F150와 함께 주문 대신 부족합니다
피어스 비오틴의 Quantitation 키트 열 과학 28,005
EZ-링크 Maleimide - PEG2 - 비오틴, 형식 없음 - 체중 열 과학 21,901
SM (PEG) N Crosslinkers 열 과학 22,107
10-20% 트리스 - 글리신 젤 Invitrogen EC61352
Laemmli 버퍼 바이오 RAD 1610737
트리스 글리신 SDS는 버퍼를 실행 Invitrogen LC2675
트리스 글리신 전송 버퍼 Invitrogen LC3675
니트로 셀룰로스 막 필터 종이 샌드위치 Invitrogen LC2001
토끼 IgG에 항체를 정제 인산 가수 분해 효소 레이블 선호도 Kirkegaard 및 페리 연구소 0751516
NBT / BCIP 인산 가수 분해 효소 기판 Kirkegaard 및 페리 연구소 508107

참고문헌

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