Zebrafish Autochthonous 종양 모델을 사용하여 흑종 조절을위한 검사

요약

zebrafish autochthonous 종양 모델을 사용하여 흑색 증 조절을위한 화면으로 빠른 방법은 제공됩니다. 그것은 melanocytes에서 후보 흑색 증의 유전자의 표현을 허용 miniCoopR 벡터의 이점을 걸립니다. 흑색 증 - 무료 생존 곡선, 침략 분석, 규모 melanocytes의 항체 염색법을위한 프로토콜과 흑색 증 이식 분석을 구하는 방법이 설명되어 있습니다.

초록

인간의 암의 게놈 연구는 종양 ^{하나, 둘, 셋에서} 변경 아르 유전자에 대한 풍부한 정보를 굴복했습니다. 이 연구에서 발생하는 문제는 많은 유전자가 변경된다는 것입니다, 그것은 모든 사람들이 변화하는 동안 부수적으로 발생한 그에서 tumorigenesis를 몰고 유전자 변경을 구분하기 어려울 수 있습니다. 이 구별을 그리려면이 양적 종양 계속하고 배포 할 수 있도록 종양 개시 및 기타 프로세스에 변경된 유전자의 효과를 측정 할 수 있습니다 검정을 가지고 유용합니다. 여기 흑색 증의 개시 및 유지 보수에 필요한 단계를 포함 autochthonous 종양 모델 ^(4)를 사용하여 zebrafish에 후보 흑색 증 조절 다수의 화면에 빠른 방법을 제시한다. 이 분석의 주요 시약 어떤 게이트웨이 재결합 카세트에 커플 mitfa melanocyte 사양 계수의 야생 형 사본을 miniCoopR 벡터, 어느 후보 멜로anoma 유전자는 ⁵ 재결합 할 수 있습니다. miniCoopR 벡터는 발기인, 오픈 읽기 프레임과 야생 형 mitfa 유전자의 3'-번역되지 않은 지역을 포함하는 mitfa의 구조를 minigene 있습니다. 우리는 후보 흑색 증 조절의 전체 길이 열려있는 독서 프레임을 사용하여 구조를 할 수 있습니다. p53의 (만약에); mitfa (LF) zebrafish의 배아 :이 각각의 클론 그런 다음 단일 셀 TG (BRAF ^V600E mitfa)에 주입 될 수있다. miniCoopR 벡터는 Tol2로 인한 transgenesis ⁶ 통합 melanocytes를 구출됩니다. 그들이 실제로 mitfa 구출 minigene에 연결되기 때문에, 후보 유전자는 변화와 종양으로 발전 할 일부의 구출 melanocytes에 표현됩니다. 흑색 증의 개시 및 흑색 증 세포의 특성에 후보 유전자의 효과가 흑색 증없는 생존 곡선, 침략의 assays, 항체 염색법과 이식 assays를 사용하여 측정 할 수 있습니다.

프로토콜

1. 흑종의 발병 조절을위한 검사

1. PCR 관심의 유전자의 전체 길이 열려있는 독서 프레임 (GOI)를 증폭하고 BP clonase II (Invitrogen)를 사용하여 pDONR 221에 ​​recombining에 의해 게이트웨이 중간 항목 클론을 만들 수 있습니다. miniCoopR 벡터 (그림 1A)에 mitfa 프로모터에서의 관심 유전자를 삽입 재조합 p5E_mitfa, pME_GOI, Tol2kit # 302 p3E_SV40polyA ⁶ miniCoopR ⁵ Multisite 게이트웨이 기술 (Invitrogen)를 사용합니다.
2. 이전 ^7에 설명 된대로 mitfa (LF) triply homozygous zebrafish의 배아, p53의 (만약에) : 한 셀 TG (BRAF ^V600E mitfa)에 25 picograms Tol2 transposase의 mRNA와 함께 각 클론의 25 picograms를 삽입. 28.5에서 주입 배아를 배양 ° C. 24 hpf에있는 죽은 태아를 제거합니다.
3. 해부 microscop에 주입 배....

결과

하나의 셀 TG (mitfa : BRAF ^V600E), p53의 (만약에), mitfa (LF) zebrafish의 배아는 흑색 증의 종양 유전자 mitfa 프로모터의 조절하에 SETDB1 5 EGFP 각을 포함하는 miniCoopR 벡터를 주입했다. melanocyte 구조와 태아가 선택되고 성숙 할 수 있었다. melanocyte 구조와 세 동물 2 개월에 4mm ^2보다 더 큰이 선택되었습니다. 동물 melanomas 주 단위로 상영되었다. 성인을위한 종양 발생률 곡선은 SETDB1 종양 유전자는 크게 EGFP 제어 (그림 1)에 비해 흑색 증의 onsetas을 가속화 것으로 나타났다. hindbrain의 뒤쪽 경계와 등쪽 지느러미 (그림 2A)의 앞 국경 사이에 종양을 개발 동물 격리되었다. 두 주 흑색 증의 발병 후에는 hem.......

토론

miniCoopR 방법은 zebrafish melanocytes에 대한 관심의 유전자의 표현이 가능합니다. 이 방법은 zebrafish mitfa 유전자가 세포 자율적으로 역할을한다는 사실을 활용합니다. 이러한 이유로, miniCoopR 벡터에 의해 구출 melanocytes는 minigene이 있고 물리적으로 연결된다에 관심이있는 유전자를 포함 할 확신합니다. 구출 melanocytes는 명확하게 볼 수 있으며, 단일 셀 배아로 주입 된 동물에서 얻을 수 있습니다. chimerism의 지정된 수준이 선택되어,이 컷오프를 능가 동물은 종양 발병 또는 기타 특성을 채점 할 수 있습니다. miniCoopR 방법의 가장 큰 장점은 충분한 chimerism과 동물 쉽게 식별하고 테스트 관심의 모든 유전자에 해당 안정적으로 유전자 변형 라인을 취득 할 필요없이 득점 할 수 있다는 것입니다. 시간과 노력, 비용을 조사 할 관심 유전자의 수에 비례에 저장됩니다.

이전

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
시약의 이름	회사	카탈로그 번호	코멘트
게이트웨이 재결합 시약	Invitrogen
miniCoopR			인용 발명 5
Mitfa 항체			인용 발명 5
FITC 염소 안티 - 토끼 IgG 항체	Invitrogen
Vectashield	벡터 연구소	H-1000
캐스퍼 Zebrafish			참조 9
701N 10 μl 주사기	해밀턴 / 피셔	14-824	및nbsp;
40 μM 필터	BD 팔콘 / 피셔	352340
FBS	Invitrogen	26140079