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방법 논문

Zebrafish Autochthonous 종양 모델을 사용하여 흑종 조절을위한 검사

13.2K 조회수

⸱

DOI:

10.3791/50086

⸱

2012년 11월 13일

 ,  , 
1Program in Molecular Medicine and Department of Cancer Biology, University of Massachusetts Medical School, 2Departments of Surgery and Medicine, Weill Cornell Medical College , 3Departments of Surgery and Medicine, New York Presbyterian Hospital

이 논문에서

요약

zebrafish autochthonous 종양 모델을 사용하여 흑색 증 조절을위한 화면으로 빠른 방법은 제공됩니다. 그것은 melanocytes에서 후보 흑색 증의 유전자의 표현을 허용 miniCoopR 벡터의 이점을 걸립니다. 흑색 증 - 무료 생존 곡선, 침략 분석, 규모 melanocytes의 항체 염색법을위한 프로토콜과 흑색 증 이식 분석을 구하는 방법이 설명되어 있습니다.

초록

인간의 암의 게놈 연구는 종양 하나, 둘, 셋에서 변경 아르 유전자에 대한 풍부한 정보를 굴복했습니다. 이 연구에서 발생하는 문제는 많은 유전자가 변경된다는 것입니다, 그것은 모든 사람들이 변화하는 동안 부수적으로 발생한 그에서 tumorigenesis를 몰고 유전자 변경을 구분하기 어려울 수 있습니다. 이 구별을 그리려면이 양적 종양 계속하고 배포 할 수 있도록 종양 개시 및 기타 프로세스에 변경된 유전자의 효과를 측정 할 수 있습니다 검정을 가지고 유용합니다. 여기 흑색 증의 개시 및 유지 보수에 필요한 단계를 포함 autochthonous 종양 모델 (4)를 사용하여 zebrafish에 후보 흑색 증 조절 다수의 화면에 빠른 방법을 제시한다. 이 분석의 주요 시약 어떤 게이트웨이 재결합 카세트에 커플 mitfa melanocyte 사양 계수의 야생 형 사본을 miniCoopR 벡터, 어느 후보 멜로anoma 유전자는 5 재결합 할 수 있습니다. miniCoopR 벡터는 발기인, 오픈 읽기 프레임과 야생 형 mitfa 유전자의 3'-번역되지 않은 지역을 포함하는 mitfa의 구조를 minigene 있습니다. 우리는 후보 흑색 증 조절의 전체 길이 열려있는 독서 프레임을 사용하여 구조를 할 수 있습니다. p53의 (만약에); mitfa (LF) zebrafish의 배아 :이 각각의 클론 그런 다음 단일 셀 TG (BRAF V600E mitfa)에 주입 될 수있다. miniCoopR 벡터는 Tol2로 인한 transgenesis 6 통합 melanocytes를 구출됩니다. 그들이 실제로 mitfa 구출 minigene에 연결되기 때문에, 후보 유전자는 변화와 종양으로 발전 할 일부의 구출 melanocytes에 표현됩니다. 흑색 증의 개시 및 흑색 증 세포의 특성에 후보 유전자의 효과가 흑색 증없는 생존 곡선, 침략의 assays, 항체 염색법과 이식 assays를 사용하여 측정 할 수 있습니다.

프로토콜

1. 흑종의 발병 조절을위한 검사

  1. PCR 관심의 유전자의 전체 길이 열려있는 독서 프레임 (GOI)를 증폭하고 BP clonase II (Invitrogen)를 사용하여 pDONR 221에 ​​recombining에 의해 게이트웨이 중간 항목 클론을 만들 수 있습니다. miniCoopR 벡터 (그림 1A)에 mitfa 프로모터에서의 관심 유전자를 삽입 재조합 p5E_mitfa, pME_GOI, Tol2kit # 302 p3E_SV40polyA 6 miniCoopR 5 Multisite 게이트웨이 기술 (Invitrogen)를 사용합니다.
  2. 이전 7에 설명 된대로 mitfa (LF) triply homozygous zebrafish의 배아, p53의 (만약에) : 한 셀 TG (BRAF V600E mitfa)에 25 picograms Tol2 transposase의 mRNA와 함께 각 클론의 25 picograms를 삽입. 28.5에서 주입 배아를 배양 ° C. 24 hpf에있는 죽은 태아를 제거합니다.
  3. 해부 microscop에 주입 배아를 포함하는 페트리 접시를 배치하여 72 hpf에서 구출 melanocytes과 유전자 변형 동물을 선택흰색 배경 (그림 1A)에 대한 입사광에 따라 5.
  4. 이전에 8에 설명 된대로 네 dpf에서 zebrafish 시설의 보육의 3 L 탱크에 동물을 전송합니다.
  5. 2개월에서 4mm 2 (그림 1A)보다 큰 melanocyte 구조의 적어도 하나의 공간이있는 동물을 선택합니다. 72 hpf에서 melanocyte 구조의 정도, 2 개월 melanocyte 구조의 정도 사이에 강한 상관 관계가 있습니다. melanocyte 구조와 태아가 72 hpf로 선택하는 경우, 그들 중 대부분 (~ 80 %) 2 개월 4mm 2보다 큰 melanocyte 구조의 적어도 하나의 영역을 갖게됩니다.
  6. 화면 종양의 존재 (그림 1B)에 대한 주간 선택한 동물. histopathologic와 morphologic 변경 사항을 사이에 강한 상관 관계가 있습니다. 양성에서 악성으로 전환이 병변은 동물의 표면을 제기 될 morphologic 변경으로 인정 받고 있습니다. 종양 베어링 애니 마을 분리연구 있나요.
  7. 종좌표에 자리표와 %의 흑색 증이없는 생존의 주 나이가 흑색 증 - 무료 생존 곡선을 그립니다. 관심있는 유전자를 표현하는 melanocytes가있는 동물은 동물을 제어하는 비교됩니다 melanocytes에서 명시 적 EGFP (강화 된 녹색 형광 단백질) (그림 1C). miniCoopR-EGFP를 주입 동물에 대한 중간 종양의 증상은 약 18 주입니다. 두 곡선이 로그 순위 테스트를 사용하여 통계적으로 다른 있는지 여부를 확인합니다.

2. 종양 침략 분석

  1. hindbrain과 등쪽 지느러미 (그림 2A)의 앞쪽에 경계의 뒤쪽 경계 사이의 지역에서, dorsally 종양을 개발하는 절연 zebrafish를 선택합니다.
  2. 흑색 증의 증상은 메사추세츠 의과 대학 기능 대학에서 안락사에 대한 미국의 동물 의료 협회 패널에 의해 지정된 및 승인 지침에 따라 물고기를 안락사시켜야 2 주 후에titutional 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC). 아가미의 움직임이 멈출 때까지 특히, 생선은 0.6 MG / ML tricaine와 함께 그릇에 배치됩니다.
  3. 메스 생선의 복막 캐비티에 절개를 확인하고 고정에 대해 4 ° C에서 밤새 4 % paraformaldehyde에있는 물고기 (PFA)를 넣습니다.
  4. 4에서 하루 아침에 0.5 M EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산)와 함께 치료 ° C가 decalcify합니다.
  5. 밤 60시 2 시간 각 2 회 ° C.를 1 시간에 크실렌 3 회와 분명 1 시간에 탈수하고 파라핀으로 처리 카세트에 포르말린으로 고정
  6. 몰드에 파라핀의 조직을 삽입하고 30 분 ~ 1 시간을 위해 더욱 강화 할 수 있습니다.
  7. 5 μm 섹션, 하나마다 50 μm하십시오. 섹션은 가로와 깊은 침략의 요점을 식별 할 수 있도록 전체 병변을 통해해야합니다. hematoxylin 및 eosin의 착색에 따릅니다.
  8. 종양 세포가 collagenous 지층 compactum 밖에 남아 있는지 여부를 측정하여 종양 침략을 평가 등쪽에 침략근육은 나 척추 (그림 2B, C)에 더 침략. 샘플의 두 집합 사이의 통계적 차이를 확인합니다.

3. 규모 Melanocytes의 항체 염색법

  1. 80 ML 0.1 M 오세영 2 HPO 4, 20 ML 0.1M 아니 2 PO 4 PO4 버퍼를 확인합니다. 산도는 7.3 있는지 확인하십시오. 8.0 g의 자당, 0.15 ML 0.2M CaCl 2, 90 ML 0.2M PO 4 버퍼, 산도 7.3을 포함하는 2 배 수정 버퍼를 확인합니다. 필요는 NaOH 또는 HCL과 7.3로 pH를 조정한다면 PO 4 버퍼 100 ML까지합니다.
  2. 300 MG 고체 PFA까지 무게 microcentrifuge 튜브에 추가합니다. PFA 4.5 X 질량, MG에서 (예를 들면 450 UL 5 MM NaOH 100 MG PFA까지)와 같은 볼륨에 5 MM NaOH를 추가합니다. 60-70에서 열 ° C PFA가 해산 될 때까지 흔들림 가끔있는. 나머지 입자를 스핀 다운 20 % PFA 표면에 뜨는을 복구합니다. 신선한 때마다 확인합니다.
  3. 1X Fi 접속 설비를 포함하는 고정 솔루션을 준비X 버퍼와 4퍼센트 PFA.
  4. 0.17 MG / ML tricaine에서 물고기를 마취.
  5. 날카로운 미세 스쳐 집게를 사용하여 등쪽의 비늘은 꺽을 해부 현미경으로 입사 광을 사용하여 규모의 melanocyte 함유 절반 (그림 3A)를 손상하지 돌봐. 직접 한 ML의 고정 솔루션과 실온에서 알을 품다,에 포셉 곳에서의 비늘가 도는 동안, ≥ 2 시간에. 물고기 물에 물고기를 전송하고 성공적인 복구를 확인하기 위해 생선을 모니터링 할 수 있습니다.
  6. 표백 색소 melanocytes는 실온에서 5 분에 PBST (1X PBS 산도 7.4, 0.1 % 트리톤 X-100) 2 번에 고정 비늘을 씻어합니다. DH 2 O. 5 개 ML에 0.4 ML 10% 코와 0.15 ML 30% H 2 O 2를 포함 한 ML을 추가 갓 만든 표백 솔루션 튜브가 열려 파열에서 가스를 방지하기 위해 parafilm이나 모자를 자물쇠에 놔. 안료는 (그림 3B, C) ​​(10 분 전형적인) 사라질 때까지 표백 계속합니다. 온도는 실온에서 5 분 동안 PBST 네 번에 씻어erature.
  7. 1X PBS 산도 7.4, 0.2 % 트리톤 X-100, 2 밀리그램 / ML BSA, 1 % DMSO, 0.02 % 할머니 3 2% 양 혈청으로 구성 블록 솔루션에 적어도 30 분을위한 블록. HRP 반응을 개발하면 할머니 3을 둡니다.
  8. 실온에서 하룻밤 블록 솔루션에 기본 항체를 품다. 당신이 그들을 침수 유지하기 위해 샘플을 통해 솔루션의 적어도 400 μl이 필요합니다.
  9. 상온에서 PBST에서 30 분의 비늘에게 3 번 씻으십시오.
  10. 2 시간에서 실온에서 블록 솔루션 야간에 차 항체를 품다.
  11. PBST + 0.1 μM의 DAPI로 10 분에 청바지.
  12. PBST로 5 분에 3 번 씻으십시오.
  13. 비늘의 오목면이 슬라이드 밑에 직면 있도록 vectashield 한 방울의 유리 슬라이드에 비늘를 장착하고 이상 유리 커버 전표를 놓습니다. 투명 매니큐어와 슬라이드의 가장자리를 밀봉하고 형광 현미경 (그림 3D, E, F, G에서 슬라이드를 관찰 ).

4. 이식 검정

  1. 이식 10 이전 감마 방사선의 25 GY 일일를 irradiating에 의해받는 2~3개월 이전 캐스퍼 9 생선을 준비합니다. 물고기는 물고기 물에 복구 할 수 있습니다.
  2. 이전에 설명 된대로 종양 - 베어링 생선 (2.2 절)을​​ 안락사시켜야.
  3. 종양을 잘라 5 % FBS와 0.9x PBS를 소독 약 5 ML 필터를 페트리 접시에 넣어. 면도기 솔루션 중에있는 종양를 분석.
  4. 실온에서 근무, 단일 세포를 얻을 수있는 P1000 피펫을 씹다. 5% FBS와 필터를 소독 0.9x PBS로 볼륨 25 ML로 구성합니다.
  5. 40 μM 메쉬 필터를 통해 필터링 할 수 있습니다.
  6. 10 분에 1,500 RPM (453 rcf)에서 Eppendorf 5810R의 탁상 원심 분리기에 봐.
  7. 표면에 뜨는를 제거하고 약 원하는 농도 (100mm 3 종양에 대한 10 7 세포를 가정)에 세포 현탁액을합니다.
  8. t를 계산그는 정확한 휴대폰 번호는 hemocytometer를 사용하여 최종 사출 볼륨이 약 5 μl이되도록 세포 현탁액을 희석. 50000 세포 주입 할 경우 예를 들어, 세포 현탁액은 10,000 세포 / μl의 최종 농도로 희석해야합니다. 세포 현탁액에게 전지 거리며 걷게을 방지하기 위해 모든 몇 분을 포함하는 관을 긋기.
  9. 2 ~ 3 배는 100 % 에탄올과 0.9x PBS와 26s 게이지 (베벨 팁) 701 N 10 μl 해밀턴 주사기를 씻으십시오. 세포 현탁액의 5 μl로 주사기를로드합니다.
  10. 0.17 MG / ML tricaine에서 방사능받는 물고기를 마취. 젖은 Kimwipe에서의 편에 자리 물고기 (그림 4A).
  11. 한 손으로 물고기를 안정화 약 반 hindbrain와 등쪽 지느러미 앞쪽 테두리의 뒤쪽 경계 사이의 복막 캐비티 위의 생선의 측면에 45 ° 각도로 일어나 직면하고있는 베벨로 바늘을 삽입합니다. 부드럽게 플런저를 (그림 4B) 우울.
  12. 생선 신선한 생선 물에 복구하고 종양 engraftment (그림 4C)를 매일 물고기를 관찰 할 수 있습니다. engraftment가 발생했습니다 경우, 지속적인 성장과 질병 개발도 볼 수 있습니다.

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결과

하나의 셀 TG (mitfa : BRAF V600E), p53의 (만약에), mitfa (LF) zebrafish의 배아는 흑색 증의 종양 유전자 mitfa 프로모터의 조절하에 SETDB1 5 EGFP 각을 포함하는 miniCoopR 벡터를 주입했다. melanocyte 구조와 태아가 선택되고 성숙 할 수 있었다. melanocyte 구조와 세 동물 2 개월에 4mm 2보다 더 큰이 선택되었습니다. 동물 melanomas 주 단위로 상영되었다. 성인을위한 종양 발생률 곡선은 SETDB1 종양 유전자는 크게 EGFP 제어 (그림 1)에 비해 흑색 증의 onsetas을 가속화 것으로 나타났다. hindbrain의 뒤쪽 경계와 등쪽 지느러미 (그림 2A)의 앞 국경 사이에 종양을 개발 동물 격리되었다. 두 주 흑색 증의 발병 후에는 hem...

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토론

miniCoopR 방법은 zebrafish melanocytes에 대한 관심의 유전자의 표현이 가능합니다. 이 방법은 zebrafish mitfa 유전자가 세포 자율적으로 역할을한다는 사실을 활용합니다. 이러한 이유로, miniCoopR 벡터에 의해 구출 melanocytes는 minigene이 있고 물리적으로 연결된다에 관심이있는 유전자를 포함 할 확신합니다. 구출 melanocytes는 명확하게 볼 수 있으며, 단일 셀 배아로 주입 된 동물에서 얻을 수 있습니다. chimerism의 지정된 수준이 선택되어,이 컷오프를 능가 동물은 종양 발병 또는 기타 특성을 채점 할 수 있습니다. miniCoopR 방법의 가장 큰 장점은 충분한 chimerism과 동물 쉽게 식별하고 테스트 관심의 모든 유전자에 해당 안정적으로 유전자 변형 라인을 취득 할 필요없이 득점 할 수 있다는 것입니다. 시간과 노력, 비용을 조사 할 관심 유전자의 수에 비례에 저장됩니다.

이전

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공개 사항

관심 없음 충돌이 선언 없습니다.

감사의 글

와 제임스 Neiswender, 순영 관이 작업에 사용 plasmids의 선물의 고 (故) 치 빈 치엔; 항체 염색법과 도움 제임스 리스터와 데이빗 Raible 우리는 그의 연구실이 기술이 처음 개발에서 박사 레너드 I. Zon 감사 microinjection 비디오. 이 작품은 CJC에 NIH 보조금 R00AR056899-03가 추진하는 사업

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
시약의 이름 회사 카탈로그 번호 코멘트
게이트웨이 재결합 시약 Invitrogen
miniCoopR 인용 발명 5
Mitfa 항체 인용 발명 5
FITC 염소 안티 - 토끼 IgG 항체 Invitrogen
Vectashield 벡터 연구소 H-1000
캐스퍼 Zebrafish 참조 9
701N 10 μl 주사기 해밀턴 / 피셔 14-824 및nbsp;
40 μM 필터 BD 팔콘 / 피셔 352340
FBS Invitrogen 26140079

참고문헌

  1. Beroukhim, R., et al. The landscape of somatic copy-number alteration across human cancers. Nature. 463, 899-905 (2010).
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  3. Lin, W. M., et al. Modeling genomic diversity and tumor dependency in malignant melanoma. Cancer Res. 68, 664-673 (2008).
  4. Patton, E. E., et al. BRAF mutations are sufficient to promote nevi formation and cooperate with p53 in the genesis of melanoma. Curr. Biol. 15, 249-254 (2005).
  5. Ceol, C. J., et al. The histone methyltransferase SETDB1 is recurrently amplified in melanoma and accelerates its onset. Nature. 471, 513-517 (2011).
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  8. Westerfield, M. The zebrafish book. A guide of the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). , 4, University of Oregon Press. (2000).
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재인쇄 및 허가

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