막 임베디드 단백질 도메인 간 상호 작용의 Biophysical 및 생화학 연구는 적절한 학습 자료를 얻는 첫 번째있는 많은 기술적 도전을 직면하고 있습니다. 이 문서는 솔루션을 핵 자기 공명 (NMR) 및 기타 분석 응용 프로그램의 구조 분석에 적합 이황화 - 안정화의 transmembrane의 펩타이드 복합체를 생산하고 정화를위한 프로토콜을 설명합니다.
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이 논문에서
요약
초록
막 단백질의 지질 내장 된 알파 - 나선형 도메인 간의 물리적 상호 작용은 막 단백질 단지의 접이식 및 조립과 같은 transmembrane (TM) 신호와 세포 표면 단백질 수준의 조절, 동적 인 프로세스에서 매우 중요한 역할을한다. 특정 시퀀스의 연결을 운전 구조적 기능을 이해하는 것은 TM의 펩타이드 단지의 정교한 biophysical 및 생화학 분석이 필요합니다. 그러나, TM 도메인의 극단적 인 소수성는 표준 펩타이드 화학 기술을 사용하여 조작하도록 매우 어렵게 만듭니다, 그리고 적절한 학습 자료의 생산은 종종 prohibitively 도전 증명한다. 펩티드는 현재 안정적으로 나선형 conformations 및 양식 단지를 채택 할 수있는 환경을 확인하는 것은 자발적으로 어려움의 추가 수준을 추가합니다. 여기 E.하에 게이 또는 자료에서 이종 dimeric TM의 펩타이드 단지의 생산을위한 절차를 제시 안부난, 따라서 핵 자기 공명에 대한 안정적인 동위 원소 라벨 (NMR) 또는 상대적으로 저렴하게 다른 응용 프로그램이 아닌 천연 아미노산의 설립을 허용. 이 방법의 주요 혁신은 TM 단지는 생산 및 세제, 지질 또는 기타 막 모방 재료로 재구성 할 때 안정적인 화학 양 론적하고 균일 한 구조를 형성 할 수 covalently 관련 (이황화-가교) 어셈블리로 정화된다는 것입니다. 우리는 하나의 TM 도메인 또는 가교 단지를 생산 여부 동등하게 적용하고 새로운 TM 시퀀스에이 방법을 조절하기위한 조언을 제공 표현과 정화에 대한 조심스럽게 최적화 된 절차를 제시한다.
서론
이 프로토콜은 세부 사항 우리가 솔루션 NMR을 사용하여 구조 연구 이황화 - 안정화 transmembrane의 단지 (TM) 펩티드를 생성하기 위해 개발 절차를. 절차는 ΔtrpLE1413 융합 시스템 (아래 참조)에 의해 부여 강력한 표현을 활용하여 정의 된 구성의 TM의 펩타이드 단지는 현대적인 다차원 NMR 실험에 사용되는 복잡한 안정적-동위 원소의 분류 기술을 사용하여 생성 할 수 있습니다. 우리는 림프구 - 활성화 immunoreceptors이 (최근 1 검토)은 TM 도메인 간의 상호 작용을 통해 여러 막 단백질 subunits에서 조립하는 방법에 대한 중요한 새로운 정보를 공개 여러 NMR 구조를 결정하기 위해 이러한 기술을 고용하고 있습니다. 이 기술은 다른 많은 막 단백질 시스템뿐만 아니라 솔루션 NMR뿐만 아니라 다운 스트림 분석 방법의 다양한 적용됩니다. 여기에 주어진 예는 기본 시스테인 잔류 물을 활용하는 동안자연스럽게 이황화 - 보세 단백질을 모방 복잡한을 만들려면 디자인은 동일하게 일반적으로 이러한 게이 및 이종 dimeric TM 단지와 같은 약한 비 공유 결합 상호 작용에 의해 함께 개최됩니다 복합체를 안정화 할 수 있도록 설계 이황화 채권을 생성에 적합합니다 표피 성장 인자 수용체는 (EGFR) 가족 단백질 2-4....
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프로토콜
1. 복제 및 구조 설계
HindIII와 BamHI 제한 사이트를 (그림 1 참조)를 사용하여 pMM-펩타이드 벡터 (이 요청시 제공 될 수 있습니다)에 관심 시퀀스를 복제. 이중 좌초 된 DNA의 삽입은 다음과 같은 순서로, 통합해야 HindIII 사이트, CNBr의 절단에 대한 단일 메티오닌 코돈, E.를 순서를 코딩 대장균 코돈 최적화 된 펩타이드, 정지 코돈, BamHI 사이트입니다. 펩타이드의 다른 모든 methionines는 제거해야하고 또한 산성 조건에서 흘리고 될 것 같은 dipeptide 순서 ASP-PRO는 피해야한다.
독특한 시스테인 잔류 물은 최종 단지에 이황화 crosslink의 원하는 위치에 따라 각 펩타이드 순서로 소개하고, 다른 모든 cysteines는 세린에게 변형해야합니다. 플라스미드은 선택 kanamycin 저항 카세트를 수행합니다.
2. trpLE - pepti의 표현드 퓨전
- (0.1 MM CaCl 2, 2 MM MgSO 4, 3g / L KH 2 PO ....
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결과
trpLE fusions에 달성 표현의 수준은 변수 첨부 된 펩타이드의 아미노 산 순서에 크게 의존한다. 그림 3은 사전 유도의 SDS-PAGE 분석 (차선 1) 시간의 수확 (차선 2) 표시 문화 1 리터과 4 ML의 니켈 매트릭스에서 순수한 그대로 trpLE-DAP12TM 융합의 약 120 밀리그램이 나왔고 문화에서 샘플. trpLE - DAP12TM 융합의 모든으로 표면에 뜨는 (레인 3)에 반대 포함 몸 펠릿 (레인 4)로 번역되었습니다.
니켈 - 정화 trpLE-DAP12TM 융합의 약 70 % dimeric 양식 (: TFA의 eluate의 비 감소 및 감소 된 샘플 그림 3, 레인 5, 6)에 이황화 - 가교했다. 이 trpLE-DAP12TM 융합을위한 일반적인 결과이지만, crosslinking 효율은 엔지니어링 cysteines의 위치와 다릅니다. DAP12TM의 펩타이드 제품은 총 CNBr .......
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토론
trpLE-TM fusions의 표현이 있습니다. 우리의 경험에서 trpLE-TM fusions이 저조한 37 ° C에서 풍부한 문화 매체에 표현되며, 여기에 설명 된 문화 조건 수율이 범위를 1-4 TM 도메인에서 포함 된 다양한 시퀀스에 대해 성공적으로 증명 50에서 150 밀리그램 / 순수 그대로 융합의 L. Fusions 인코딩은 세 또는 네 TM GPCR 조각 (인간의 CCR5 각각 TM1-TM3 및 TM4-TM7), 또는 인간의 신호 펩티드 peptidase (4 TM 도메인, 심판 15 참조)의 핵심 촉매 조각은 표현의 범위에서 최저를 나타냅니다 레벨 동안 밀접 범위 (게시되지 않은 데이터)의 최고 끝을 나타내는 여기에 사용 된 순서에 관한 DAP12TM 변종. 최적의 IPTG의 농도는 각각의 새로운 순서에 대해 실험적으로 결정해야합니다. 우리 표준은 0.1 MM, 높은 농도 (최대 1 ㎜) 보통 모두 낮은 표현 수준에 따라 크게 감소 수율 및 낮은 문화 밀도의 결과입니다t의 수.......
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공개 사항
제작자들은 더 경쟁 금융 이익이 없다는 점 선언합니다.
감사의 글
멕과 빅토리아 정부 (VESKI 혁신 동지,이 작품에 대한 자금 지원은 국민 건강과 호주의 의학 연구위원회 (WEHI에 독립적 인 연구소 인프라 지원 계획은 [IRIISS] 부여 멕과 MJC에 NHMRC 프로젝트 보조금 1,011,352)에 의해 제공된다; WEHI에 빅토리아 주 정부 운영 인프라 지원). 멕는 호주 연구 협의회의 엘리자베스 2 세 여왕 동지이다. EFXB는 멜버른 대학에서 노마 힐다 슈스터 장학금 프로그램의 지원을 인정합니다.
....액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 시약 / 재료의 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 코멘트 |
| 시안 브로마이드 | 올드리치 | P.No-C91492, CAS-506-68-3 | 유해 약물. 위험물. 흡입에 의해 매우 독성, 피부에 접촉하고있는 경우는 삼켰다. 산과의 접촉은 매우 독성 가스를 liberates. 수생 생물에 매우 유독, 수생 환경에 장기적인 악영향을 일으킬 수 있습니다. |
| Trifluoroacetic 산 | 시그마 - 알드리치 | P.CODE - 1000984387, CAS 번호 76-05-1 | 유해 약물. 위험물이 있습니다., 심각한 화상을 일으킨다. 흡입에 의한 유해. 수생 생물에 유해, 수생 환경에 장기적인 악영향을 일으킬 수 있습니다. |
| 2 - 메르 캅토 에탄올 | 시그마 - 알드리치 | P.No M7154, CAS 번호 60-24-2 | 유해 약물. 위험물. 흡입에 의한, 피부 접촉 및 삼킨 경우 독성. 피부에 자극. 눈에 심각한 손상의 위험. 피부 접촉에 의해 sensitization의 원인이 될 수 있습니다. 수생 생물에 매우 유독, 수생 환경에 장기적인 악영향을 일으킬 수 있습니다. |
| 1,1,1,3,3,3 - Hexafluoro-2 - 프로 파놀 | 시그마 - 알드리치 | 제품 번호 52512, CAS-아냐. 920-66-1 | 유해 약물. 위험물. 흡입에 의한 위험하고 경우가 삼켰다. 화상됩니다. |
| 개미의 산 | 머크 KGaA | K41186564 | 가연성 액체 및 증기. 심각한 피부 화상 및 눈 손상을 발생합니다. |
| 요소 | UNIVAR, AJAX FINECHEM | 제품 번호, 817, CAS - 아니, 57-13-6 | 가열, 12 월이산화탄소와 암모니아로 omposes, 구운 경우, 질소 산화물의 작은 양을 방출. 빨갛게 및 피부와 눈의 자극을 일으킬 수 있습니다. |
| 구아니딘 히드로 클로라이드 | Amresco | P.No-M110, CAS 번호 : 50-01-1 | 삼킨 경우 유해한, 심각한 눈 염증을 일으킨다 피부 자극, 급성 독성 구강, 피부 자극, 눈 자극이 발생합니다. |
| 트리톤 X-100 | 시그마 | 제품 번호 - T8532 CAS 번호 : 9002-93-1 | 트리톤 X-100는 종종 단백질을 solubilize하기 위해 생화학 응용 프로그램에서 사용하는 nonionic 세제, 100 % 활성 성분입니다. 트리톤 X-100는 항균 특성을가 없으며, 비교적 온화한 비 denaturing 세제를 고려 |
| 그의 - 선택 니켈 - 선호도 젤 | 시그마 - 알드리치 | 카탈로그 개수-P6611 | IS-선택 니켈 선호도 젤은 고정 금속 이온 친화도 크로마토 그래피 (아이맥) 제품입니다. HIS - 선택 닉엘 선호도 젤은 특별히 히스티딘이 포함 된 단백질에 바인딩하도록 설계되어 니켈 혐의로 기소 구슬 아가로 오스의 독점적 인 quadridentate 킬레이트입니다. |
| (-)-글루타티온, 산화 | 시그마 - 알드리치 | 카탈로그 NUM 150,568 | |
| Misonix S-3000 sonicator | QSONICA | S-3000 (단종) | 최대 전원 출력 600w. 0.5 인치 교체 - 팁 프로브는 0.5 인치 높은 강도, 높은 볼륨 팁과 높은 강도, 낮은 볼륨 팁의 범위를 걸립니다. 이 회사에서 현재 사용할 수있는 가장 가까운 모델은 Q500 및 Q700 있습니다. |
| RP-HPLC : 생물학적 DuoFlow 크로마토 그래피 시스템, 소프트웨어 버전 5.3 | 바이오 RAD 연구소 | 카탈로그 개수 760-0047, 구성 번호 : AU500571, 시리얼 번호 : 484BR3705 | 펩티드는 높은 AQ의 위상 HPLC 컬럼을 취소에 바인딩ueous 모바일 위상 및 높은 유기 모바일 위상과 RP HPLC 컬럼에서 용출되어 있습니다. RP에서 HPLC의 펩티드들은 소수성 문자에 따라 구분됩니다. 펩티드는 유기 용매의 선형 그라데이션을 실행하여 분리 할 수 있습니다. |
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참고문헌
- Call, M. E., Chou, J. J. A view into the blind spot: solution NMR provides new insights into signal transduction across the lipid bilayer. Structure. 18, 1559-1569 (2010).
- Bocharov, E. V., et al.
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재인쇄 및 허가
