Method Article

증식하는 연속 고해상도 현미경으로 관찰 신진 효모의 노화

DOI:

10.3791/50143

⸱

August 20th, 2013

 ,  ,  ,  , 
1Molecular Systems Biology, Groningen Biomolecular Sciences and Biotechnology Institute, University of Groningen, 2Department for the Biology of Ageing, European Research Institute for the Biology of Ageing, University Medical Centre Groningen, University of Groningen, 3Institute of Biochemistry, ETH Zurich, 4Department of Health Sciences and Technology, ETH Zurich, 5Institute of Molecular Systems Biology, ETH Zurich

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

우리는 여기에서 자신의 완전한 증식하는 및 / 또는 연대순 수명 기간 동안 하나의 신진 효모 세포의 연속 고해상도 현미경 이미징을 허용 microfluidic 장치의 동작을 설명합니다.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

우리는 단 하나 싹 트는 효모 세포가 자신의 전체 수명에 걸쳐 추적 할 수있는 간단한 미세 설정의 사용을 보여줍니다. 미세 유체 칩은 micropads의 배열을 사용하여 어머니와 딸 세포 사이의 크기 차이를 이용합니다. micropad 및 커버 유리 사이의 거리가 효모 세포 (3-4 μm의)의 직경과 비슷하기 때문에로드 할 때, 세포는, 이러한 micropads 아래에 갇혀있다. 로딩 과정을 거친 후, 배양액을 연속적으로 그들의 작은 크기로 인해 패드 아래에 유지되지 않습니다 새로운 딸 세포 밖으로 플러시 또한 전체 실험을하는 동안 상수 정의 환경을 만들어뿐만 아니라 칩을 통해 플러시되지만. 설정은 하나의 실험에서 50까지 각각의 세포가 더 필요한 경우 5 일 동안 완전 자동화 된 방식으로 모니터링하거나 할 수 있도록 효율적으로 어머니 세포를 유지합니다. 또한, 칩의 우수한 광학 특성은 높은 수전체 노화 과정에서 세포의 고해상도 영상.

Introduction

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효모 신진은 연구 1 노화에 대한 중요한 모델 생물이다. 최근 효모 세포 노화 증식하는 공부를 할 때까지 각각의 봉오리를 수동으로 어머니 세포 2,3에서 제거하는, 해부 방법을 필요로하는 힘든 과정이었다. 이 문제를 해결하기 위해, 우리는 최근 자신의 전체 수명 4를 통해 각각의 어머니 세포를 추적 할 새로운 마이크로 유체 설치를 발표했다.

우리의 마이크로 유체 칩, 효모 세포는 (그림 1 참조) 부드러운 탄성 중합체 기반 micropads 아래에 갇혀있다. 매체의 지속적인 흐름이 떨어져 새로 형성 딸 세포를 세척하고 신선한 영양소와 세포를 제공합니다. 한 실험에서 50까지 어머니 세포는 그들의 전체 증식하는 수명에 걸쳐 완전 자동화 된 방식으로 모니터링 할 수 있습니다. 미세 유체 칩의 우수한 광학 특성으로 인해, 그것은 동시에 효모 세포 생물학의 다양한 측면 (예를 들어 모니터링 할 수 있습니다 형광 단백질)를 사용하여.

고전적인 절개 방법에 비해 미세 설정은 상당한 이점을 제공합니다. 그것은 전체 노화 실험 기간 동안 ....

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Protocol

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1. 실리콘 웨이퍼 금형의 생산 및 준비

마이크로 유체 칩은 소프트 리소그래피에 의해 생성 된 실리콘 웨이퍼 형에서 만들어집니다. 이 웨이퍼는 마이크로 유체 칩을 생산하기 위해 여러 번 재사용 할 수 있습니다. 그것은 각각의 웨이퍼 생산 미세 유체 6 전문 그룹에 의해 수행되는 것이 바람직하다.

웨이퍼 네거티브 포토 레지스트의 두 가지 층, SU-8 7을 사용하여 두 단계의 포토 리소그래피 공정에서 이루어집니다. 채널이 상위 계층 (, 높이 10 μm의 SU-8 2010)로 만들어진 반면,, 바닥 층은 세포 트래핑 지역 (높이 3 ~ 4 μm의 SU-8 2002)를 생성하는 데 사용됩니다. 웨이퍼 생산 공정의 인상 황 등 8에서 찾을 수 있습니다. 미세 유체 칩의 그림은 각각의 웨이퍼를 구하는 방법에 대한 저자뿐만 아니라 조언을 얻을 수 있습니다.

  1. 웨이퍼가 얻어지면, 터프 태그 INT의 한 조각을 잘라메스 입구 채널과 micropad 배열 (그림 2A) 사이의 채널 구조의 상단에 약간 웨이퍼 신중하게 장소 3mm로 약 0.5 mm의 O 얇은 스트립. 이것은 세포로드....

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Results

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이 프로토콜에서는, 세포는 주로 중간 지수 문화 미세 유체 칩에로드됩니다. 미세 유체 칩에 갇혀 세포의 연령 분포가로드되기 전에 문화의 그것과 유사 여부를 확인하기 위해, 세포 봉오리 상처를 시각화하는 FITC에 복합 밀 agglutinin을 (WGA-FITC)로 염색 하였다. 그림 3에서 볼 수 있듯이, 미세 유체 칩의 micropads에 따라 세포의 함정 수사는 특정 연령의 세포에 편향되지 않습니다.

증식하는 수명은 단순히 하나의 어머니 세포에 의해 생산되는 싹의 수를 계산하여 결정하실 수 있습니다. 이 데이터는 생성 꽃 봉오리의 수에 대한 가능한 세포의 비율을 플로팅하여 수명 곡선으로 변환됩니다. 같은 Kaeberlein, 외. 9에 의해 수행 된 것과 통계적 테스트는 서로 다른 실험에서 수명 데이터를 비교하는 데 사용할 수 있습니다. 그림 4는 수명 곡선의 예를 보여줍니다W.......

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Discussion

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여기에 설명 된 미세 메서드는 지속적으로 높은 해상도 이미지와 함께 효모 증식하는 수명 데이터를 간단하고 자동 생성을 가능으로 노화 연구에 중요한 새로운 도구입니다. 이러한 특성은 고전적인 절개 방법의 실험 가능성에 큰 개선이다, 그러나 고려해야하는 방법의 몇 가지 제한이 있습니다.

micropad에서 보관 모든 셀 (이웃 세포의 신진 셀 예를 들어 그것을 멀리 밀어 수있는 칩에서 밖으로 세척 할 특정 확률이있다 : 결정 증식하는 수명이 어머니 세포의 유지의 효율성에 의해 영향을받을 수있는 주 micropad). 셀의 통합 가능성은 증가 수명과 증가 씻어 수 있습니다. 따라서, 수명이 짧은 세포는 수명이 긴 전지보다 멀리 세척하기 전에 자신의 라이프 사이클을 완료 가능성이 높습니다. 그와 비슷한 리튬 사실 이러한 잠재적 인 문제가없는 경미한이고, 그렇지 않으면 나타냅니다 클래식 microdissection을 방법 11-13에서와 .......

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Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

저자는 그들이 더 경쟁 재정적 이익이 없다는 것을 선언합니다.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

우리는 미토콘드리아 형태학을 기록 세포 로딩 프로토콜과 마커스 드 Goffau 및 인 Guille Zampar의 첫 번째 버전을 작성하기위한 로라 Schippers에게 감사의 말씀을 전합니다.

....

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
REAGENTS
DC Sylgard 184 엘라스토머 Mavom bv1060040이 패키지에는 PDMS 베이스 및 PDMS 경화제가 포함되어 있습니다.
유리 페트리 접시 120/20mm VWR International391-2850
커버 안경 22x40mm CBN Labsuppliers BV190002240
Tough-Tags 시그마 알드리치Z359106
알루미늄 호일
플라스틱 일회용 컵
혈청학 피펫 5ml VWR International612-1245
스카치 테이프 VWR International819-1460
Baysilone 페이스트 (GE Bayer 실리콘) Sigma-Aldrich85403-1EA
PTFE 마이크로 보어 튜빙, 0.012 "ID x 0.030"OD Cole ParmerEW-06417-11얇은 튜빙이라고합니다
Tygon 마이크로 보어 튜빙, 0.030 "ID x 0.090"OD 콜 파머EW-06418-03두꺼운 튜브라고하는
메스 VWR International233-5334
50ml Luer-Lok 주사기 BD300137
5ml 주사기, Luer 팁 VWR International613-1599
핀셋 VWR International232-2132
20 게이지 Luer 스텁 Instech SolomonLS20
주사기 필터(기공 크기 0.20 μ m) Sigma-Aldrich16534K
스테인레스 스틸 카테터 플러그, 20 ga x12 mm Instech SolomonSP20/12
페트리 접시 VWR International391-0892
EQUIPMENT
Benchtop UV-Ozone Cleaner NOVA ScanPSD-UVT
Harvard Pump 11 Elite Harvard Apparatus70-4505
SU-8 실리콘 마스터 몰드 (웨이퍼) 자체 제작; 자세한 내용은 교신저자
Balance Sartorius corporationED4202S
진공 펌프 KNF NeubergerN022 AN.18
Desiccator VWR International467-2115
Hot plate VWR International460-3267
Optional: 커버 유리용 금속 홀더 (22x40 mm) 자체 제작; 자세한 내용은 교신저자
(형광) 60x 대물렌즈, 자동 초점, 타임 랩스 기능 및 자동(전동 XY 제어) 스테이지 NikonEclipse Ti-E
가 있는 현미경 에 문의하십시오.

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Kaeberlein, M., McVey, M., Guarente, L. Using yeast to discover the fountain of youth. Sci. Aging Knowledge Environ. 2001 (1), pe1(2001).
  2. Mortimer, R. K., Johnston, J. R. Life span of individual yeast cells. Nature. 183 (4677), 1751-1752 (1959).
  3. Steffen, K. K., Kennedy, B. K., Kaeberlein....

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