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방법 논문

증식하는 연속 고해상도 현미경으로 관찰 신진 효모의 노화

12.4K 조회수

⸱

DOI:

10.3791/50143

⸱

2013년 8월 20일

 ,  ,  ,  , 
1Molecular Systems Biology, Groningen Biomolecular Sciences and Biotechnology Institute, University of Groningen, 2Department for the Biology of Ageing, European Research Institute for the Biology of Ageing, University Medical Centre Groningen, University of Groningen, 3Institute of Biochemistry, ETH Zurich, 4Department of Health Sciences and Technology, ETH Zurich, 5Institute of Molecular Systems Biology, ETH Zurich

이 논문에서

요약

우리는 여기에서 자신의 완전한 증식하는 및 / 또는 연대순 수명 기간 동안 하나의 신진 효모 세포의 연속 고해상도 현미경 이미징을 허용 microfluidic 장치의 동작을 설명합니다.

초록

우리는 단 하나 싹 트는 효모 세포가 자신의 전체 수명에 걸쳐 추적 할 수있는 간단한 미세 설정의 사용을 보여줍니다. 미세 유체 칩은 micropads의 배열을 사용하여 어머니와 딸 세포 사이의 크기 차이를 이용합니다. micropad 및 커버 유리 사이의 거리가 효모 세포 (3-4 μm의)의 직경과 비슷하기 때문에로드 할 때, 세포는, 이러한 micropads 아래에 갇혀있다. 로딩 과정을 거친 후, 배양액을 연속적으로 그들의 작은 크기로 인해 패드 아래에 유지되지 않습니다 새로운 딸 세포 밖으로 플러시 또한 전체 실험을하는 동안 상수 정의 환경을 만들어뿐만 아니라 칩을 통해 플러시되지만. 설정은 하나의 실험에서 50까지 각각의 세포가 더 필요한 경우 5 일 동안 완전 자동화 된 방식으로 모니터링하거나 할 수 있도록 효율적으로 어머니 세포를 유지합니다. 또한, 칩의 우수한 광학 특성은 높은 수전체 노화 과정에서 세포의 고해상도 영상.

서론

효모 신진은 연구 1 노화에 대한 중요한 모델 생물이다. 최근 효모 세포 노화 증식하는 공부를 할 때까지 각각의 봉오리를 수동으로 어머니 세포 2,3에서 제거하는, 해부 방법을 필요로하는 힘든 과정이었다. 이 문제를 해결하기 위해, 우리는 최근 자신의 전체 수명 4를 통해 각각의 어머니 세포를 추적 할 새로운 마이크로 유체 설치를 발표했다.

우리의 마이크로 유체 칩, 효모 세포는 (그림 1 참조) 부드러운 탄성 중합체 기반 micropads 아래에 갇혀있다. 매체의 지속적인 흐름이 떨어져 새로 형성 딸 세포를 세척하고 신선한 영양소와 세포를 제공합니다. 한 실험에서 50까지 어머니 세포는 그들의 전체 증식하는 수명에 걸쳐 완전 자동화 된 방식으로 모니터링 할 수 있습니다. 미세 유체 칩의 우수한 광학 특성으로 인해, 그것은 동시에 효모 세포 생물학의 다양한 측면 (예를 들어 모니터링 할 수 있습니다 형광 단백질)를 사용하여.

고전적인 절개 방법에 비해 미세 설정은 상당한 이점을 제공합니다. 그것은 전체 노화 실험 기간 동안 정의 및 지속적인 환경을 보장합니다. 그것은 고가의 전문 장비를 필요로하지 않고 자동 초점과 시간 경과 능력을 가지고뿐만 아니라 온도 제어 세포 재배되어 어떤 현미경에서 실행할 수 있습니다. 미세 유체 칩의 생산 작업은 몇 일 이내에 배울 수 있습니다. 또한, 세포는 주로 기하 급수적으로 증가 문화, 어머니 세포의 biotinylation을 필요로하는 다른 최근 발표 된 미세 방법 5에 비해 이점에서로드 할 수 있습니다.은 여기에 설명 된 방법은 점진적인 변화를 측정하는 데 사용할 수있는 고해상도 이미지와 결합 세포 형태에서, 효모 동안 단백질 발현 및 현지화은 전례없는 방식으로 노화. 의 기능단일 세포의 장기 모니터링은 또한 효모 세포주기 연구에 대한 독특한 가능성을 제공합니다.

이 방법은 최근에이 원고 검토에있는 동안 출판 된 프로토콜 16에서 biotinylation을 제거하는 최적화되었습니다.

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프로토콜

1. 실리콘 웨이퍼 금형의 생산 및 준비

마이크로 유체 칩은 소프트 리소그래피에 의해 생성 된 실리콘 웨이퍼 형에서 만들어집니다. 이 웨이퍼는 마이크로 유체 칩을 생산하기 위해 여러 번 재사용 할 수 있습니다. 그것은 각각의 웨이퍼 생산 미세 유체 6 전문 그룹에 의해 수행되는 것이 바람직하다.

웨이퍼 네거티브 포토 레지스트의 두 가지 층, SU-8 7을 사용하여 두 단계의 포토 리소그래피 공정에서 이루어집니다. 채널이 상위 계층 (, 높이 10 μm의 SU-8 2010)로 만들어진 반면,, 바닥 층은 세포 트래핑 지역 (높이 3 ~ 4 μm의 SU-8 2002)를 생성하는 데 사용됩니다. 웨이퍼 생산 공정의 인상 황 등 8에서 찾을 수 있습니다. 미세 유체 칩의 그림은 각각의 웨이퍼를 구하는 방법에 대한 저자뿐만 아니라 조언을 얻을 수 있습니다.

  1. 웨이퍼가 얻어지면, 터프 태그 INT의 한 조각을 잘라메스 입구 채널과 micropad 배열 (그림 2A) 사이의 채널 구조의 상단에 약간 웨이퍼 신중하게 장소 3mm로 약 0.5 mm의 O 얇은 스트립. 이것은 세포로드하는 동안 사용하지 않을 각 칩에 큰 추가 채널의 형성을 초래할 있지만, microfluidic 장치의 안정적인 작동을 위해 중요하다 할 것이다.
  2. 알루미늄 호일의 이중 레이어로 유리 페트리 접시를 커버하고 페트리 접시에 웨이퍼를 넣어. 알루미늄 호일은 웨이퍼와 페트리 접시 사이에서 실행 PDMS를 방지 할 수 있습니다. PDMS는 웨이​​퍼와 유리 페트리 접시 사이에 크리프 않는 경우, 웨이퍼는 페트리 접시에 영구적으로 고정 될 것입니다. 웨이퍼는 여전히 쓸모 있지만 그것은 휴식과 PDMS 나중에 잘라해야 할 경우, 그것은 유리 페트리 접시를 대체 할 수 없습니다.

2. 미세 유체 칩의 제조

  1. 빈 플라스틱을 배치균형과 용기 균형 컵. 플라스틱 컵 (12 cm 직경의 유리 페트리 접시 용)에 40g PDMS 기반을 붓는다. 4 ML 약 1:10의 IE AW / W 비율 일회용 피펫 PDMS 경화제를 추가합니다.
  2. 몇 분 동안 충분히 PDMS와 경화제를 혼합한다. 이 경화제를 피펫하는 데 사용 된 일회용 플라스틱 피펫을 수행 할 수 있습니다. 그것은 혼합이 잘 웨이퍼의 상단에 쏟아져하기 전에 혼합하는 것이 중요합니다. 별로 혼합은 중합하지 PDMS의 일부 원인이됩니다.
  3. 유리 페트리 접시에 웨이퍼 위에 PDMS를 부어.
  4. 경화 에이전트와 PDMS의 혼합은 PDMS 혼합물에서 거품 형성으로 이어질 것입니다. 이 거품은 PDMS는 중합하기 전에 제거해야합니다. PDMS는 진공 펌프에 연결된 건조기에 페트리 접시를 배치하여 웨이퍼의 상단에 붓는 한 후 탈기 할 수 있습니다. 이 설정으로, 그것은 혼합물에서 모든 거품을 제거하기 위해 약 30 분 소요됩니다.
  5. 일을 중합다른 시간 동안 65 ° C에서 다음 1 시간에 대해 120 ° C에서 핫 플레이트의 상단에 웨이퍼 페트리 접시를 배치하여 전자 PDMS.
  6. 유리 페트리 접시에서 웨이퍼와 중합 PDMS와 함께 알루미늄 호일을 제거합니다. 알루미늄 호일 및 웨이퍼의 후면에서 중합 된 PDMS의 얇은 잔존 층을 벗겨. 웨이퍼 위에 PDMS의 레이어는 조심스럽게 들어 올려서 웨이퍼로부터 분리 할 수​​ 있습니다.
  7. 벤치에 거꾸로 (위로 향하게 채널) PDMS 층을 놓고 메스 조심스럽게 PDMS에 각인 단일 칩 디자인을 잘라. 나중에 커버 유리에 칩 부착을 향상시키기 위해 채널의 가장자리 주위 PDMS의 약 3 mm의 유지하려고합니다.
  8. 직선 방식으로 PDMS를 통해 20 게이지 루어 스텁 모든 방법을 밀어 입구, 출구 및 측면 채널 (그림 2A)의 끝에서 PDMS의 펀치 구멍.

확인 PDMS 칩구멍을 뚫는 동안 계속 벤치에 거꾸로 누워있다. 이 채널의 막힘을 일으킬 수있는 채널의 안쪽에 붙는 PDMS를 방지 할 수 있습니다.

  1. 각각의 구멍을 펀칭 한 후, 다시 스텁을 잡아 당겨 전에 핀셋 루어 스텁에서 PDMS의 열을 제거합니다. PDMS 열 그렇지 않으면 뒤에 남아서 그냥 펀치 구멍을 차단할 수 있습니다.
  2. 거기에 스카치 테이프를 배치하고 즉시 다시 테이프를 제거하여 먼지 입자와 잔류 PDMS에서 칩의 표면을 청소합니다. 마찬가지로 칩이 장착 될 수있는 커버 유리를 청소하십시오.
  3. 벤치 탑 UV-오존 클리너 UV 램프 아래의 청소 칩과 커버 유리를 놓습니다. 함께 결합해야 할 측면은 램프에 직면해야합니다.
  4. PDMS를 노출하고 6-8 분 동안 UV 빛 유리를 커버하고 직접 그 후 서로의 상단에 노출 된 표면을 배치하여 커버 유리에 칩을 넣어.
  5. 부드럽게 칩의 가장자리에 살짝커버 유리에 PDMS의 부착을 촉진하고 공기 방울을 제거 할 수 있습니다. 이 micropads이뿐만 아니라 커버 유리에 집착하는 원인이 될 수 있으므로 채널 구조의 상단에 탭하지 마십시오.
  6. 60 분 동안 100 ° C에서 뜨거운 접시에 새로 만들어진 미세 설정을 놓습니다. 약간 PDMS 칩의 가장자리를 들어 올려 노력에 의해 커버 유리와 PDMS 칩 사이의 결합의 강도를 테스트합니다. PDMS 블록은 유리 표면에서 채취 할 수없는 경우, 결합은 성공하고 칩 사용할 수 있습니다.

3. 셀 로딩을위한 칩을 준비

microfluidic 장치의 고장 가능성 현미경으로 매체의 누출을 일으킬 수 있습니다. 이를 방지하기 위해, 금속 홀더 및 /를 사용하거나 PDMS 매니큐어 에폭시 접착제로 유리를 충족 칩의 측면을 밀봉하기 위하여 자문이다. 이 PDMS 칩은 커버 유리에 충분히 접착되지 않은 경우 매체의 누설을 방지합니다. 또한 튜브연결 매체의 누설을 방지하기 위해 비슷한 방법으로 삽입 지점 주위에 고정 할 수 있습니다. 누설의 경우에는 주사기 펌프를 꺼 집에서 만든 물 센서는 별도의 안전 조치로 사용할 수 있습니다. 특히 미세 유체 칩 설계 금속 홀더의 그림은 저자에서 얻을 수 있습니다.

  1. 칩의 유리 방수 씰을 만들 수있는 홀더의 금속 부분 사이에 실리콘 젤, 금속 홀더에 마이크로 유체 칩을 놓습니다. 유리를 깰하지 부드럽게 너트를 고정합니다.
  2. 얇은 튜브 (ca. 5~15센티미터 긴) 측 채널 칩의 출구 채널에 연결합니다. 족집게의 사용은 쉽게 구멍을 뚫은 구멍에 튜브를 삽입 할 수 있습니다.
  3. 배지에 50 ML 루어 하이록 주사기를 채우기 주사기에서 공기를 제거하고 주사기 필터, 20 게이지 루어 스텁, 짧은 두꺼운 튜브 (ca. 2cm 길이) 및 얇은 관을 순차적으로 연결합니다. 있는지 확인 얇은 욕조E는 주사기 펌프 및 현미경 스테이지 사이의 거리를 확장 할 충분한 시간이다.
  4. 빨리 감기 얇은 관까지 펌프가 완전히 배지로 가득합니다, 주사기 펌프에 주사기를 놓습니다.
  5. 칩의 입구 채널로 주사기에 연결된 얇은 관을 누르고 10 μL / 분 (그림 2B)에서 칩을 통해 매체의 흐름을 보자. 칩 (페트리 접시에 예) 남겨 매체를 수집합니다. 매체 때문에 터프 태그가 큰 쪽 채널 및 출구 채널을 만든 사이의 저항 차이의 측면 채널을 통해 밖으로 실행됩니다.
  6. 현미경 단계에 칩을 넣고 패드에 현미경의 초점을 설정합니다.

기름이 실험의 시간 과정을 통해 건조하지 않기 때문에 기름 침지 목적의 사용은 침수 목표의 선호된다.

현미경에 따라 F를 유지에 문제가있을 수 있습니다실험의 초기 시간 동안 ocus. 그것은 세포를로드하고 실험을 시작하기 전에 정착 할 수 있도록 현미경 스테이지에서 하나에 두 시간 동안 칩을두고하는 것이 좋습니다.

4. 미세 유체 칩에 효모 세포의로드

  1. 20 게이지 루어 스텁과 두꺼운 튜브 (ca. 3cm)에 5 ML 루어 팁 주사기를 연결합니다.
  2. 칩에로드 할 세포 배양의 샘플을 채취.

로딩 선호 세포 수는 ML 당 1-5 X 10 6 세포 사이입니다. 높은 세포 수와 문화 적재하기 전에 희석해야합니다. 세포가 처음으로 세척 및로드하기 전에 유사한 포도당 비율을 포함하는 최소 배지에 현탁 된 경우 YPD에 배양 세포는 세포 적재 효율은 많은 배 향상 할 수있는 경우. 칩의 동작 중에, YPD 배지를 다시 안전하게 사용할 수 있습니다.

  1. 일에 세포 현탁액의 약 1 mL를로드전자 주사기와 주사기에서 모든 공기를 제거합니다.
  2. 0.5 μL / 분에 주사기 펌프의 유량을 감소시킨다. 로딩 중 주사기 펌프 (단계 4.5)에 의해 적용 낮고 지속적인 흐름 측면 채널 (그림 2C)를 통해 비 부착 세포를 밀어 것입니다.
  3. 출구 채널의 튜브에 세포 현탁액을 포함하는 주사기를 연결합니다. 조심스럽게 주사기의 플런저를 눌러 셀을로드합니다. 들어오고 눈을 통해 micropads 아래 나 컴퓨터 화면을 통해 침전 세포를 관찰합니다.
  4. 충분한 세포 패드 아래에 정착 될 때까지 플런저에 압력을 유지한다. 최적의 부하 패드 당 1-3 세포이다. 세포가 무작위 패드 아래에 정착, 그것은 몇 패드는 모든 세포와 다른 패드가 완전히 세포로 채워 포함하지 않는 것이 매우 일반적입니다.
  5. 셀 로딩 및 출구 채널의 얇은 튜브에서 연결된 두꺼운 튜브에 사용되는 주사기를 분리 측 채널을 플러시높은 유량 (10 μL / 분)에서 몇 분에 대한 annel 기포 및 / 또는 아직 칩 (그림 2B)를 종료하지 않은 세포를 제거합니다. 세포는 옆 채널에서 제거되지 않을 경우, 그들은 측 채널에 성장을 시작하고 나중에 실험을 방해 할 수 있습니다.
  6. 다시 아래 0.5 μL / 분에 주사기 펌프의 흐름을 넣고 그 끝 (그림 2D)에서 카테터 플러그인을 포함하는 두꺼운 튜브 (ca. 5cm 길이)에 연결하여 사이드 채널을 닫습니다.
  7. 1-5 μL / min의 최종 유속 흐름을 증가. 유량은 중간과 효모 균주에 따라 달라질 수 있습니다.
  8. 실험의 목표에 적합한 현미경과 카메라 설정에 동영상을 시작합니다. 현미경 스테이지의 속도는 오일이 따를 수있는 그런 낮은 속도로 설정되어 있는지 확인합니다. 증식하는 수명, 이미지 세포를 10 분 간격으로 측정합니다. 할로겐에 의해 방출 된 UV 빛의 미세한로부터 세포를 보호하려면DIC 수집하는 동안 사용되는 램프, 그것은 빛의 경로에 추가 UV 필터를 배치하는 것이 좋습니다. 형광 현미경을 사용하는 경우, 그것은 광독성 효과를 방지하기 위해 (매 20 분 등) 자주 이미지 셀을하는 것이 바람직하다. 실험은 실험 시작시에로드 된 모든 세포가 정상적인 조건 아래에서 일이 소요되는 죽은 때 완료됩니다. 그것은 정기적으로 실험하는 동안 이미지의 초점을 검사하고 필요한 경우이를 조정하는 것이 좋습니다.

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결과

이 프로토콜에서는, 세포는 주로 중간 지수 문화 미세 유체 칩에로드됩니다. 미세 유체 칩에 갇혀 세포의 연령 분포가로드되기 전에 문화의 그것과 유사 여부를 확인하기 위해, 세포 봉오리 상처를 시각화하는 FITC에 복합 밀 agglutinin을 (WGA-FITC)로 염색 하였다. 그림 3에서 볼 수 있듯이, 미세 유체 칩의 micropads에 따라 세포의 함정 수사는 특정 연령의 세포에 편향되지 않습니다.

증식하는 수명은 단순히 하나의 어머니 세포에 의해 생산되는 싹의 수를 계산하여 결정하실 수 있습니다. 이 데이터는 생성 꽃 봉오리의 수에 대한 가능한 세포의 비율을 플로팅하여 수명 곡선으로 변환됩니다. 같은 Kaeberlein, 외. 9에 의해 수행 된 것과 통계적 테스트는 서로 다른 실험에서 수명 데이터를 비교하는 데 사용할 수 있습니다. 그림 4는 수명 곡선의 예를 보여줍니다W...

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토론

여기에 설명 된 미세 메서드는 지속적으로 높은 해상도 이미지와 함께 효모 증식하는 수명 데이터를 간단하고 자동 생성을 가능으로 노화 연구에 중요한 새로운 도구입니다. 이러한 특성은 고전적인 절개 방법의 실험 가능성에 큰 개선이다, 그러나 고려해야하는 방법의 몇 가지 제한이 있습니다.

micropad에서 보관 모든 셀 (이웃 세포의 신진 셀 예를 들어 그것을 멀리 밀어 수있는 칩에서 밖으로 세척 할 특정 확률이있다 : 결정 증식하는 수명이 어머니 세포의 유지의 효율성에 의해 영향을받을 수있는 주 micropad). 셀의 통합 가능성은 증가 수명과 증가 씻어 수 있습니다. 따라서, 수명이 짧은 세포는 수명이 긴 전지보다 멀리 세척하기 전에 자신의 라이프 사이클을 완료 가능성이 높습니다. 그와 비슷한 리튬 사실 이러한 잠재적 인 문제가없는 경미한이고, 그렇지 않으면 나타냅니다 클래식 microdissection을 방법 11-13에서와 ...

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공개 사항

저자는 그들이 더 경쟁 재정적 이익이 없다는 것을 선언합니다.

감사의 글

우리는 미토콘드리아 형태학을 기록 세포 로딩 프로토콜과 마커스 드 Goffau 및 인 Guille Zampar의 첫 번째 버전을 작성하기위한 로라 Schippers에게 감사의 말씀을 전합니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
REAGENTS
DC Sylgard 184 엘라스토머 Mavom bv1060040이 패키지에는 PDMS 베이스 및 PDMS 경화제가 포함되어 있습니다.
유리 페트리 접시 120/20mm VWR International391-2850
커버 안경 22x40mm CBN Labsuppliers BV190002240
Tough-Tags 시그마 알드리치Z359106
알루미늄 호일
플라스틱 일회용 컵
혈청학 피펫 5ml VWR International612-1245
스카치 테이프 VWR International819-1460
Baysilone 페이스트 (GE Bayer 실리콘) Sigma-Aldrich85403-1EA
PTFE 마이크로 보어 튜빙, 0.012 "ID x 0.030"OD Cole ParmerEW-06417-11얇은 튜빙이라고합니다
Tygon 마이크로 보어 튜빙, 0.030 "ID x 0.090"OD 콜 파머EW-06418-03두꺼운 튜브라고하는
메스 VWR International233-5334
50ml Luer-Lok 주사기 BD300137
5ml 주사기, Luer 팁 VWR International613-1599
핀셋 VWR International232-2132
20 게이지 Luer 스텁 Instech SolomonLS20
주사기 필터(기공 크기 0.20 μ m) Sigma-Aldrich16534K
스테인레스 스틸 카테터 플러그, 20 ga x12 mm Instech SolomonSP20/12
페트리 접시 VWR International391-0892
EQUIPMENT
Benchtop UV-Ozone Cleaner NOVA ScanPSD-UVT
Harvard Pump 11 Elite Harvard Apparatus70-4505
SU-8 실리콘 마스터 몰드 (웨이퍼) 자체 제작; 자세한 내용은 교신저자
Balance Sartorius corporationED4202S
진공 펌프 KNF NeubergerN022 AN.18
Desiccator VWR International467-2115
Hot plate VWR International460-3267
Optional: 커버 유리용 금속 홀더 (22x40 mm) 자체 제작; 자세한 내용은 교신저자
(형광) 60x 대물렌즈, 자동 초점, 타임 랩스 기능 및 자동(전동 XY 제어) 스테이지 NikonEclipse Ti-E
가 있는 현미경 에 문의하십시오.

참고문헌

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