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방법 논문

손쥐 심방과 심실 Cardiomyocytes의 절연 및 KV 채널 레코딩

12.8K 조회수

⸱

DOI:

10.3791/50145

⸱

2013년 3월 12일

 ,  ,  ,  ,  , 
1Experimental and Clinical Research Center (ECRC), Charité Medical Faculty and Max-Delbrück Center for Molecular Medicine (MDC), 2Medical Department, Division of Cardiology, Campus Virchow-Klinikum, Charité - Universitätsmedizin Berlin, 3Medical Department, Division of Cardiology and Angiology, Campus Mitte, Charité - Universitätsmedizin Berlin

이 논문에서

요약

KV 채널 장애는 심장 arrhythmias과 연결되어 있습니다. 우리가 KV 채널 보조의 subunit의 녹아웃 마우스에서 심방과 심실 cardiomyocytes의 분리에 대한 체계적인 프로토콜을 활용 이러한 arrhythmias로 이어질 분자 메커니즘을 연구하기 위해. 절연 cardiomyocytes는 다음 즉시 세포 electrophysiological 연구, 생화학 또는 immunofluorescence (IF) assays에 사용하실 수 있습니다.

초록

KCNE 유전자는 기능적 속성을 수정할 수 KV 채널 알파 subunits로 heteromeric 단지를 형성 KV 채널 보조의 subunits의 작은 가족 인코딩합니다. KCNE 유전자의 변이는 같은 긴 QT 증후군 및 / 또는 심방 세동 등의 심장 arrhythmias 환자에서 발견되었습니다. 그러나, 이러한 질병에 이르게 정확한 분자 pathophysiology은 어려운 남아 있습니다. 이전 연구에서이 유전자에 변이를 일으키는 질병의 electrophysiological 속성은 대부분 heterologous 표현 시스템에서 공부하고 있으며보고 된 효과가 직접 네이티브 cardiomyocytes로 번역 할 수 있다면 우리는 확신 할 수 없습니다. 저희 연구실에서는 따라서 다른 방법을 사용합니다. 우리가 시각화 실험의 저널이 문제에 대해 설명하는 고유 한 기술 - 우리가 직접 세포 전기 생리학의 녹아웃 마우스에서 분리 된 cardiomyocytes에 KCNE 유전자 삭제의 효과를 공부합니다. genetica에서 마음베드로 설계 KCNE 마우스는 빠르게 excised과 대동맥 cannulation로 Langendorff 장치에 장착되어 있습니다. 심근에서의 자유 칼슘 2 +는 EGTA에 의해 구속되고, 심장 근세포의 분리는 다음 전문 낮은 칼슘 2 + 버퍼를 포함하는 collagenase와 관상 동맥의 역행 재관류에 의해 달성된다. 심방, 무료 오른쪽 심실 벽과 왼쪽 심실 그런 다음 microsurgical 기법으로 구분 될 수있다. 칼슘은 천천히 세척 절차를 포함하는 여러 단계에서 분리 된 cardiomyocytes으로 추가됩니다. 더 자연 수축과 건강한 모양의 심방과 심실 cardiomyocytes는 다음 즉시 분리 후 첫 6 시간 내에 패치 클램프 기술 또는 다른 생화학 분석하여 electrophysiological 분석의 대상이됩니다.

프로토콜

1. 동물 마취 및 장기 수확

  1. 케타민 (200 밀리그램 / kg BW)과 Xylazine (20 MG / kg BW)의 intraperitoneal (IP) 주입하여 마우스를 마취시키다.
  2. 혈액 응고와 혈전 형성을 방지하기 위해 250 IU 헤파린의 IP를 삽입 anticoagulate 할 수 있습니다.
  3. 깊은 마취법은 areflexia 특징으로하는,에 도달 할 때까지 기다립니다. 부드럽게 꼬리 곤란에 의한 각막이나 시험 비행 반사을 터치하여 areflexia, 테스트 각막 반사를 확인합니다.
  4. 운영 테이블에 마우스를 전송하고 나태한 위치에서 문제를 해결.
  5. 피부와 검상 돌기 아래의 복부 벽을 절개하고 탄두 thoracotomy를 수행 늑골 아치를 따라 양쪽으로 컷을 연장하고 이후 중간 겨드랑 선에서 갈비를 잘라, 갈비 위쪽으로 편향.
  6. , 심낭을 엽니 다 큰 혈관을 찾습니다. 부드럽게 잘 대동맥을 표시 할 심장 꼬리를 누르십시오. 집게를 사용하여 대동맥을 고정.
  7. s의 쌍 오목에 마음을 놓으십시오 cissors 한 싱글 컷 모든 연결 혈관을 해부. Langendorff의 cannulation에 대한 오름차순 대동맥의 큰 부족 부분을 보존해야합니다.
  8. 얼음 추위와 사전 oxygenized 솔루션 1 (솔루션, 표 1 참조)로 가득 찬 페트리 접시에 즉시 excised 마음을 전송합니다.

2. 마음을 Langendorff 살포의 작성

  1. 1.8F 강철 캐뉼라과 대동맥을 Cannulate. 공기 색전증을 방지해야합니다.
  2. 솔루션 1 개 중 1 ML과 수술 봉합 및 수세식 coronaries와 캐뉼라에 대동맥을 흥분시키는.
  3. Langendorff 장치와 캐뉼라를 연결합니다.
  4. thoracotomy에서 Langendorff의 cannulation 할 시간이 있는지 확인 심근에 확장 국소 빈혈 / reperfusion 부상을 방지하기 위해 120 초를 초과하지 않습니다.
  5. 칼슘이 10 ML과 Perfuse 마음 + 무료 솔루션이 (4 ML ​​/ 분).
  6. 8 분 (4 ML / 분)에 대한 collagenase 솔루션 3 Perfuse 마음.
심장 챔버 르 "> 3. Microsurgical 분리

  1. 낮은 칼슘 2 + 솔루션 4를 포함하는 미리 예열 100 mm 페트리 접시에 전송 심장.
  2. 조심스럽게 가위로 대동맥 및 기타 비 심장 조직을 제거하고 폐기합니다.
  3. 별도의 심방과 심실하여 따로 챔버를 계속합니다. 해결 방법 4에 익숙해 세포세요. 작은 볼륨을 (이하 5 ML)을 사용합니다.

4. Cardiomyocytes의 추가 분리

  1. 심방 cardiomyocytes :
    1. 심방 cardiomyocytes은 별도의 사전 예열 100-mm 배양 접시에 심방를 전송하고 부드럽게 고급 집게로 떨어져 당기는를 통해 조직을 떼어 놓다 개별화합니다. 조직의 거의 완전한 분리를 확인하십시오.
    2. 5 분을위한 솔루션을 5 단계 중 1 ML에있는 세포를 일시 중지 할 수 확대 화재 광택 플라스틱 피펫 팁으로 1 ML의 피펫을 사용합니다.
    3. 셀 필터 (200 μm의 메쉬 크기)를 사용하여 쓰레기들로부터 세포를 분리합니다.
      4. <리> 5 ML의 세포 현탁액에 대한 솔루션 5 실내 온도 16 XG에서 2 분을위한 원심 분리기를 추가합니다.
    4. 다음 단계는 세포 배양 후드 아래 운영하고 있습니다. 솔루션 6 5 ML의 표면에 뜨는하고 다시 일시 중지 펠릿을 폐기하십시오.
    5. 15 ML 튜브에 10 분에 중력에 의해 침강 후, 상온 16 XG에서 1 분 동안 원심 분리기. 표면에 뜨는을 제거합니다. 솔루션 6 1-5 ML에서 자신의 양에 따라 세포를 다시 일시 중지합니다.
  2. 심실 cardiomyocytes :
    1. 해결 방법 4 5 ML에서 고급 집게와 관심의 왼쪽 심실 지역을 해부.
    2. 세포의 대부분이 분리 될 때까지 부드럽게 pipetting하여 세포를 일시 중지합니다. 50 ML 튜브에 (200 μm의 메쉬 크기) 필터링 한 후 셀 솔루션을 전송 25 ML의 볼륨을 추가 할 수 있습니다.
    3. 실내 온도 16 XG에서 2 분 동안 원심 분리기.
    4. 다음 단계는 세포 배양 후드 아래 운영하고 있습니다. 표면에 뜨는 제거의 25 ML에있는 펠릿을 다시 일시 중지솔루션 6 10 분의 세포의 침강 할 수 있습니다.
    5. 세포를 계산하고 표면에 뜨는을 제거, 25를 추가 - 50 ML 솔루션 6 셀에.

5. 생물 세포 전기 생리학, 또는 연구 IF Cardiomyocytes의 작성

  1. 전기 생리학 연구를 들어, 50 ML 튜브에 솔루션 6 근세포를 유지하고 침전을 억제.
  2. 에 대한 생화학 연구, 예를 들어 칼슘 이미징, laminin 코팅 세포 배양 접시에 판 근세포 (최종 농도 20 μg / PBS에 ML laminin).
  3. immunofluorescence 얼룩은 유리 커버 용지로 세포 배양 접시 판을 준비하고 laminin 솔루션 (최종 농도 50 μg / PBS에 ML laminin)으로 코팅하십시오.
    1. 도금 근세포 전에 솔루션을 제거합니다. 플레이트 세포를과 현미경을 사용하여 세포 밀도를 제어합니다.
    2. 2퍼센트 CO 2에 37 번 1 시간에 슬립 ° C를 충당하기 위해 근세포가 준수 가자, 솔루션을 제거및 표준 착색 절차 프로토콜 즉시 시작합니다.
    3. 실온에서 10 분 동안 PBS의 정착액, 예를 4퍼센트 PFA (산도 7.5)으로 배양하고 5 분마다 세 PBS 세척 단계를 따르십시오.
    4. 세포를 permeabilize하고 바인딩 불특정 항체가 10 % 혈청, 0.3 % 트리톤, 실온에서 30 분을위한 PBS에 0.​​2 % BSA와 근세포을 길러 억제 할 수 있습니다.
    5. 37 1 시간에 대한 기본 항체와 함께 배양 ° C와 같은 이전에 설명 씻는다.
    6. 상온에서 1 시간을위한 차 항체를 품다. 핵을 counterstain 및 α-actinin 사용 DAPI와 fluorochrome 복합 phalloidin (알렉사 형석 488, Invitrogen)합니다.
    7. 세척 후, 유리 커버 형광 장착 매체에 실란 처리 현미경 슬라이드와 소스 세포에 조심스럽게 미끄러 전송할 수 있습니다.

6. 세포 전기 생리학

  1. fre에 전체 세포 패치 - 클램프 녹음을 수행shly 실온에서 심방과 심실 cardiomyocytes을 분리.
  2. 세포 목욕 솔루션의 정의 볼륨 가득 재관류 챔버에 건강 나타나지 cardiomyocytes을 전송합니다. 117 MM NaCl, 4 MM KCl, 1 ㎜ KH 2 PO 4, 4 MM NaHCO 3, 1.7 MM MgCl 2, 3 MM CoCl 2, 10 밀리미터 HEPES, 10 MM 포도당과 0.02 밀리미터 테트로도톡신 (TTX), (산도 7.4) . 산도 값 조정 NaOH를 사용하십시오.
  3. (예 : IX71 역 현미경, Multiclamp 700B 앰프, pClamp10.3 소프트웨어 (분자 ​​장치)와 Digidata 1440A 수집 시스템 및 PC) 적절한 패치 클램프 장비를 사용합니다.
  4. 이 CP 없음 130 MM KCl, 2 MM MgCl 2, 11 MM HEPES, 11 MM EGTA, 5 MM 그렇단이 ATP, 0.4 MM 그렇단이 GTP, 5 MM를 포함하는 세포 솔루션으로 가득 할 때 MΩ 3-5의 저항과 패치 피펫을 사용하여 및 4.9 MM CaCl 2 (산도 7.2). 산도 값 조정 코를 사용하십시오.
  5. 외부 K + 전류 뒤를 그대로 보여주고 있습니다링 4.5 초 전압 단계는 -60와 20 밀리 초는 -40 뮤직 비디오에 prepulse 후 -70 mV의 개최 가능성에서 10-MV 단위 50 MV 사이의 잠재력을 테스트합니다.
  6. 누설 전류는 항상 <100 PA되어 있는지 확인합니다.
  7. , Heteropodatoxin 2 (HpTx2, Alomone) 또는 Tetraethylammonium (차, 시그마), 다른 K의 해부를 들어 + 전류는 4 aminopyridine (ICN의 Biomedicals, 어바인, CA, USA 4 AP) 등의 특정 억제제를 사용합니다. 증권 솔루션은 세포 목욕 용액에 준비하고, "기준"녹음 후 microtip을 통해 세포의 가장 가까운 가능한 주변에 직접 적용해야합니다. 평균은 "약물"녹음하기 전에 2-3 분 동안 허용해야합니다.
  8. 분석을 위해 셀 크기에 개별 셀 (전체 세포 막 커패시턴스)의 현재 진폭을 정상화. pClamp10.3 소프트웨어 (분자 장치) 또는 유사한 소프트웨어를 사용하여 오프라인 데이터를 분석합니다.

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결과

체외에 대한 관심의 특정 유전자의 기능을 연구하기 위해 유전자 변형 생쥐에서 성인용 손쥐 cardiomyocytes의 절연은 또한 심장 pathophysiology을 이해 할 수있는 강력한 도구가되었습니다. 이 방법은 현재 전 세계적으로 기초 과학 연구소 만 작지만 증가에 의해 사용됩니다. 그러나, 성인 심실 손쥐 cardiomyocytes의 격리하지 않냐는 경험이 풍부한 손으로 철저하고 반복적으로 수행해야 할 수 있습니다. 그림 1은 신선한 격리 된 표본 심방과 심실 cardiomyocytes을 보여줍니다. 심실 cardiomyocytes를 들어 우리는 더 자연 수축과 함께 건강한 모습의 막대 모양, 줄무늬 심실 근세포를 사용하는 것이 좋습니다. 심실 근세포에 비해 심방 근세포는 짧고 얇은 있습니다. 심실 cardiomyocytes의 특성 결과 막대 모양은 성인 심방 손쥐 cardiomyocytes에서 누락되어 있습니다. 심실 cardiomyocytes에 대한 수율은 격리1x10...

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토론

유전자 삭제와 관련된 심장 기능 및 심장 병리학을 연구하는 유전자 변형 마우스 변종의 증가 개발 체외에서 특정 유전자 삭제 효과를 공부하는 전문 방법에 증가 관심도 있습니다. 저희 연구실에서는 심장 repolarization에 KV 채널 보조의 subunits의 가족의 역할을 공부합니다. KCNE 유전자는 KCNEs 자신에 대한 칼륨 전류를 전달할 수 없습니다 하나의 transmembrane 도메인 KV 채널 부수적 인 subunits 수 있습니다. 인간의 심실과 심방 repolarization 11, 15 중요한 역할을 다섯 유전자 (KCNE1-5)의 가족을 포함하지만, 수 KV 채널 알파 subunits로 단지를 형성하고 크게 같은 세포 내 게이팅, 전도성, 약리학 및 트래픽 관리 등의 기능 속성을 조절. 예를 들어, 변이 및 KCNE2의 일반적인 polymorphisms는 상속 및 인수 형태의 O와 연결되어 있습니다F 롱 ...

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공개 사항

우리는 공개 할 아무 것도 없습니다.

감사의 글

이 작품은 독일 Forschungsgemeinschaft (DFG), 프리츠 - 티센 (Thyssen) - Stiftung 및 Charité / MDC에서 교부금의 지원을받는되었다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
시약의 이름 회사
테트로도톡신 Alomone
4 aminopyridine ICN의 Biomedicals
Heteropodatoxin 2 Alomone
Tetraethylammonium 시그마 화학 물질
Collagenase의 제 2 형 워싱턴

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