여기에서 우리는 사멸 세포 간극의 역학을 공부하는 효과적인 방법을 설명 생체 내. 이 방법은 살고 채용 초파리 사멸 세포와 대 식세포의 특정 레이블을 사용하여 세포 사멸 세포의 감시 식균 작용을위한 강력한 모델로 배아.
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이 논문에서
요약
초록
세포 사멸 및 후속 식균 작용을 통해 원치 않는 또는 비정상적인 세포의 적절한 제거는 (사멸 세포 간극) 모든 후생 생물의 정상적인 발달을 위해 중요합니다. 사멸 세포 간극은 밀접하게 세포의 죽음과 관련된 매우 역동적 인 과정이다 unengulfed 사멸 세포는 거의 정상적인 조건 하에서 생체 내에서 볼 수 있습니다. 사멸 세포 간극의 여러 단계를 이해하고 '전문'식세포와 비교하기 위해 -에 대 식세포와 수지상 세포를 '비 전문'- 조직 상주 이웃 세포 프로세스의 생체 라이브 이미징은 매우 중요합니다. 여기에서 우리는 라이브 Drosophila의 배아에서 세포 사멸 세포 간극 공부를위한 프로토콜을 설명합니다. 우리는 사멸 세포와 대 식세포에 대한 특정 마커를 사용 식균 작용에서 여러 단계의 역학을 따르십시오. 또한, 우리는 병렬로 두 개의 식세포 시스템을 모니터링 할 수 있습니다 : '전문'대 식세포와 '반 profe개발 중추 신경계 ssional '아교 (CNS). 여기에 설명 된 방법은 사멸 세포 간극의 실시간 연구를위한 훌륭한 모델로 Drosophila의 배아를 사용합니다.
서론
세포 사멸 및 후속 식균 작용을 통해 원치 않는 또는 비정상적인 세포의 적절한 제거는 배아 발달뿐만 아니라 성인에서 조직의 항상성을 위해 중요합니다. 사멸 세포 또는 사멸 세포 간극의 식균 작용은 네 단계로 진행 매우 역동적 인 과정이다 : 사멸 세포에 대한 식세포 (1) 모집 ( '찾기 - 나'), 식균 작용의 대상으로 셀 (2) 인식 ( '- 저를 먹고')와 (3) engulfment, 세포 사멸 입자 1-5 (4) phagosome에 성숙과 분해에 의해 따랐다. '전문'대식 세포와 미성숙 수지상 세포, 그리고 '비 직업적인'조직 상주 이웃 세포 후생 개발 6,7시 사멸 세포 통관을 위해 매우 중요하다 할 : 식세포의 두 가지 유형이 있습니다.
초파리 개발, 세포 사멸을 통해 불필요한 세포의 제거는 삼m에서 발생늦게 배아 중반 처음으로, 그 중간 번데기, 그리고 다시 성인 초기의 아인 단계. 배아 동안 세포 사멸 입자는 '전문'식세포, 대 식세포, 그리고 '비 직업적인'외배엽과 glia의 8,9에 의해 제거된다....
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프로토콜
포식 세포 사멸 세포 : 세포의 두 집단을 표시해야합니다 생체 내에서 사멸 세포 간극의 역학을 따르십시오.
대식 세포, 아교 세포 및 외배엽 8 : 우리가 시뮬레이션 할 cytGFP의 배아에서 독점적 식세포 레이블을 마커를 포함하는 초파리 줄을 사용 탐식 세포 인구를 표시합니다. 하나는 혈구 특정 GAL4 드라이버 (CRQ-GAL4)를 포함하는 선 또는 glia의 특정 GAL4 드라이버 (REPO-GAL4)와 UAS 제어 (UAS - GFP)에 따라 유전자 인코딩 형광 리포터 등 식세포에 대해 서로 다른 마커를 사용할 수 있습니다.
사멸 세포 통관시 사멸 세포를 모니터링하려면 우리는 다른 세포 사멸 / 식균 작용 마커를 사용합니다. 아 넥신 V (분자 프로브) 10 사멸 세포에 대한 초기 마커 역할, Phiphilux (OncoImmunin)는 나중에 apopto로 사용되는 형광 카스파 제 3 기판이며,SIS 마커 및 LysoTracker (분자 프로브) phagosome에 마커로 작동합니다. 우리는 microinjection의 시스템 PicoPump P....
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결과
사멸 세포 넥신 V로 표시되며, 아교, 외배엽 및 대 식세포를 시뮬레이션 할 cytGFP으로 표시되는 동영상에서 대표 프레임은 그림 2에 표시됩니다. 각 프레임은 3 조각 2 μm의 각의 투영이다.
단계 15 배아가 제대로 잘 표시 아교 (G)와 함께 중간에 배아 CNS를 보여주는 배치됩니다. CNS 밖에 대부분이다 식세포 (남성), 강한 세포질 GFP 발현을 보여줍니다. 외배엽 세포는 세포질 GFP (E)로 표시되어 있습니다. 많은 넥신 V 양성 세포는 중추 신경계 내부와 외부에서 볼 수 있습니다. engulfment 이벤트를 따라하는 것은 쉬운 일이 아닙니다. 우리는 아교 세포 사멸 입자를 침몰되는 흰색 사각형 하나의 이벤트를 강조했다. 아교 세포의 프로빙 문제 참고 :이 침몰하지 않고 세포 사멸 입자를 몇 번 터치하고 다음 넥신 V의 engulfment과 결말은 사멸 세포 (그림 2 표시 <.......
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토론
사멸 세포 간극은 매우 동적이며 세포 사멸의 중요한 마지막 단계입니다. 따라서 프로세스의 실시간 연구는 매우 중요합니다. 여기에 우리가 개발 Drosophila의 배아 집에서 사멸 세포 간극의 모니터링을 가능하게하는 프로토콜을 설명합니다. 사멸 세포 탐식이 절차에서는 세포의 두 집단은 특정 마커를 사용하여 표시해야합니다. 시뮬 cytGFP 기자가 같은 배아에서 동시에 식세포 대 식세포, 아교 및 외배엽 모니터링을 위해 적당하다, w의 hich은 가능한 같은 시간에 다른 포식 세포 인구를 따라 할 수 있습니다. 이 같은 속도, 특이성 및 분해 기능 등 프로세스의 특정 측면을 비교, 동시에 '전문'과 '비 직업적인'정리 공부를위한 큰 장점이다. 이 방법의 단점은 시뮬레이션 할 cytGFP 마커가 대 식세포에 매우 강력하게 표현 훨씬 약한 것입니다같은 영화에서 조정하는 까다로운 일이 될 수 교세포. 그러나 한 특정 Gal4s (대 식세포와 .......
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공개 사항
저자는 그들이 더 경쟁 재정적 이익이 없다는 것을 선언합니다.
감사의 글
이 작품은 마리 퀴리 재 통합 그랜트 (IRG249084)에 의해 지원되었다. 우리는 Kurant 실험실의 모든 구성원을 감사드립니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| Reagent | |||
| Annexin V | Molecular Probes | A35108 | |
| PhiPhiLux G2D2 | OncoImmunin | A304R2G-5 | |
| LysoTracker | Molecular Probes | L-7528 | |
| Halocarbon oil 700 | Sigma | H8898 | |
| < 강력 > 재질 < / 강력 > | |||
| 모세관 튜빙 | FHC | 30-30-0 | |
| 셀 스트레이너 | SPL | 93100 | |
| 페인트 브러시 |
참고문헌
- Kinchen, J. M. A model to die for: signaling to apoptotic cell removal in worm, fly and mouse. Apoptosis. 15, 998-1006 (2010).
- Kinchen, J. M., Ravichandran, K. S. Phagosome maturation: going through the acid test. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 9, 78....
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재인쇄 및 허가
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