전립선의 감염은 만성 prostatitis의 골반 통증을 중재에 기여 요소가 될 수 있습니다. 우리는 표준화 된 박테리아 inoculum, 시간이 지남에 따라 마우스에 촉각 allodynia을 측정하는 남성 마우스 및 방법론의 요도에 박테리아의 기지의 준비에 대한 절차를 설명합니다.
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이 논문에서
요약
초록
Uropathogenic 대장균 (UPEC)는 요로 감염 및 세균 prostatitis 1 중요한 역할을 병원균입니다. 우리는 최근에 UPEC는 만성 골반 통증 2, 만성 prostatitis / 만성 골반 통증 증후군 (CP / CPPS) 3,4의 기능의 개시에 중요한 역할을하는 것으로 나타났습니다. 임상 관련 UPEC하여 전립선의 감염은 조직 손상과 autoimmunity 5 메커니즘의 개시를 포함 할 수 있습니다 메커니즘을 통해 만성 통증을 시작하고 설정할 수 있습니다.
전립선에 UPEC의 pathogenesis를 이해하는 데 도전 조작에 전립선의 상대적 어려움입니다. 우리는이를 통해 전립선의 오름차순 감염을 수립 남성 생쥐에 UPEC의 임상 부담이 제공하는 이전에 설명 intraurethral 감염 방법 6을 활용. 여기, 우리는 학사 학위를 표준화에 대한 우리의 프로토콜을 설명뿐만 아니라 박테리아의 기지에 anesthetized 남성 쥐를 catheterizing 절차 등 cterial inoculum 7.
CP / CPPS는 주로 촉각 allodynia (4)의 존재에 의해 특징입니다. 동작 테스트는 언급 내장 통증 8-10으로 인한 피부 hyperalgesia의 개념을 기반으로했다. 내장 조직에 짜증 초점은 일반적으로 비 고통스러운 자극 (allodynia)에 대한 과장된 반응을 허용하는 피부 통증 임계 값을 감소시킵니다. 기본 내장 고통의 강도를 증가하는 경향이 이상 반응의 피부 결과 정상적인 힘의 응용 프로그램입니다. 우리는 UPEC 박테리아와 하나의 감염에 대한 응답으로 시간이 지남에 촉각 allodynia를 정할 폰 프라이 섬유를 활용 NOD / ShiLtJ 마우스에 방법을 설명합니다.
프로토콜
1. 마우스 접종에 대한 박테리아 준비
다음은 무균 조건 하에서 수행되어야합니다.
- 모자와 하나 17 × 100 밀리미터 폴리 프로필렌 튜브를 타고 신선한 Luria 국물 (LB) 미디어 3 ML를 추가합니다. autoclaved 팁을 사용하면, 스트레인 CP1 2의 일부 냉동 박테리아 글리세롤 주식을 가지고 LB 미디어를 포함하는 관에 문화의 작은 수량을 전송할 수 있습니다. 산소는 여전히 튜브를 입력 할 수 있도록 튜브 캡을 교체 - 문화 에어로빅 조건 하에서 성장해야합니다. 37 번 장소 튜브 ° 하루 아침에 220 rpm으로 흔들어 보육의 C.
- 그 다음날, 3 ML의 LB 미디어와 함께 새로운 튜브에 밤 문화의 5 μl를 전송하고 37 ° C.에서 보육 밤의 정적 조건 하에서 성장
- 날 AA 50 ML 튜브에 3 전송 문화의 40 μl는 40 ML의 LB 미디어 각을 포함. 37 ° C 정적 보육의 하룻밤의 장소.
- 켜, 4 ° C.에 원심 분리기를 설정일단 원심 분리기 최종 온도에 도달, 40 ML Nalgene의 원심 분리기 튜브에 각각 40 ML 문화를 전송할 수 있습니다.
- 필요에 따라 LB 미디어와 함께 볼륨을 조절 - 원심 분리기의 균형을 튜브를 무게. 20 분에 6,000 rpm으로 튜브를 봐.
- 조심스럽게 표면에 뜨는 제거하고 부드럽게 40 ML 멸균 PBS에서 박테리아 펠렛을 일시 중지합니다.
- PBS와 단계 1.5를 반복합니다.
- 표면에 뜨는을 대기음, 500 μl 멸균 PBS에서 박테리아를 일시 중지합니다. 1.5 ML의 microfuge 관에 솔루션을 전송합니다. 정지 10 μl를 타고 얼음처럼 차가운 PBS의 990 μl에 희석. 접종에 필요한 볼륨을 확인하려면 OD 420의 NM을 읽어 분광 광도계를 사용합니다. 의 적절한 볼륨을 확인하려면 얼음처럼 차가운 PBS가 펠릿을 중지 할 수 : OD 420의 나노 번호 (ML)를 타고 박테리아 펠렛 [예의 예상 볼륨을 뺍니다. OD 420 nm 정도 = 0.545, 펠렛 약 0.075 ML. 0.545-0.075 = 0.470].
- 10 박테리아 정지 μl와 디를 제거990 μl 얼음처럼 차가운 PBS의 류트. OD 420의 나노를 참조하십시오. 목표는 1.000의 희석 정지 ± 0.010을위한 OD 420의 nm의 값을 달성하는 것입니다. 귀하의 희석의 수가이 목표를 초과하면, 정지에 더 많은 볼륨을 추가하고 또 다른 읽기를. 수 아래 인 경우 0.990는 원하는 반응을 얻을 때까지 중지 및 반복 OD 420의 나노 읽기 스핀 다운.
2. 동물 감염
마우스 (5-7주 세, 그룹 당 10)가 잭슨 연구소 (바 하버, ME)에서 구입했다.
- 마우스는 Plexiglas 챔버에서 isoflurane 1~4%의 흡입에 의한 anesthetized하고 휴식하고있는 때까지 모니터링한다.
- 한 번에 하나의 마우스는 유리 해밀턴 주사기 (1.5-2.0 cm의 길이)의 수정 된 30 G 바늘에 부착 된 폴리에틸렌 (PE10) 카테터와 catheterization에 의해 박테리아의 기지에 이루어집니다. 카테터는 바늘의 허브에 삽입됩니다. 마우스 plac입니다에드는 마취상의 등쪽 표면에 코 콘을 사용하여 유지.
- 마우스의 음경은 음경 요도의 입구의 윤활에 사용되는 부드러운 압력과 면봉에 윤활제의 자유 양에 의해 압출입니다.
- 10 μl 인산염은 버퍼 1 개 10 8 박테리아를 포함하는 염분은 catheterization 다음 anesthetized 마우스의 요도에 소개되어 있습니다.
- 세균 첨부 파일을 허용하고 즉각적인 배뇨을 방지하기 위해 세균 소개 한 후 마우스가 Plexiglas 챔버에서 15 분 동안 anesthetized 상태로 유지됩니다.
- 마우스들은 케이지에 다시 배치하고 24 시간 모니터링하고 있습니다.
3. 동작 테스트
마우스는 사전 감염 (기준)과 일 3, 7, 14, 21, 감염 후 28 테스트되었습니다. 라고 hyperalgesia와 촉각 allodynia은 복부 11,12과 발바닥 R에 적용 폰 프라이의 필라멘트를 사용하여 테스트되었습니다뒷다리 앞발로 땅을 차다 13 egion. 테스트는 시간의 하루 고정에 perfomed 된 표준 방법론과 모든 동물의 한 실험 테스트는 고용했다. 그룹의 눈이 멀어 테스트는 동물 모델에서 동작 기반의 통증 테스트의 한계를 방지하기 위해 활용되었다. 0.04의 힘, 0.16, 0.4, 1.0 및 4.0 g (Stoelting, USA)와 다섯 개인 폰 프라이의 필라멘트가 탈퇴 응답의 복부 및 주파수에 적용되었다가 계산되었습니다.
- 새 환경 순응의 30 분 기간 후, 마우스는 스테인레스 스틸 와이어 그리드 바닥 - 집에서 만든 개인 Plexiglas 챔버 (6 × 10 x12 cm)에 배치됩니다.
- 라고 hyperalgesia와 촉각 allodynia은 다섯 폰 프라이의 필라멘트를 사용하여 테스트되었습니다. 각 필라멘트는 총 10 회에 5 초의 상호 자극 간격으로 1-2 초에 대해 적용하고, 머리카락이 힘의 오름차순으로 테스트되었습니다.
- 각 필라멘트는 전립선의 일반적인 주변에 낮은 복부 지역에 적용되고주의 desensitization을 피하거나 효과 "를 맺어야"이 지역 내의 다른 지역을 자극하는 촬영되었습니다. 필라멘트는 10 배의 총 stimulations 사이에 최소 5 초 간격으로 1-2 초에 대해 힘의 순서를 증가에 적용되었습니다.
- 행동의 세 가지 유형은 필라멘트 자극에 긍정적 인 반응으로 간주됩니다 : 복부 1) 날카로운 철회, 2) 즉시 핥아 또는 필라멘트 자극의 지역을 긁적, 3) 점프.
- 응답 주파수는 긍정적 인 반응의 비율 (10 중에 10 = 50 % 예를 들어 5 응답)로 계산 및 데이터가 응답 주파수의 평균 비율 ± SE로보고되었다
- 25 개 이상의 긍정적 총 기본 응답과 동물은 연구에서 제외됩니다.
- 촉각 allodynia는 0.04의 힘, 0.16, 0.4, 1.0 및 4.0 g과 폰 프라이의 필라멘트를 사용하여 뒷다리 손 안에 발바닥 지역에서 테스트되었습니다. 중간 50 % 탈퇴 임계 값 (5)이 위, 아래를 사용하여 평가 한필라멘트가 약간 구부러 때까지 테스트가 0.04 g 필라멘트로 시작 방법은 뒷다리 손 안에 발바닥 표면에 수직 적용. 필라멘트는 긍정적 인 반응이 관찰 될 때까지 오름차순으로 테스트되었습니다. 필라멘트에 대한 긍정적 인 반응은 테스트 손 안에 앞발로 땅을 차다이나 핥아의 날카로운 철회 중 하나로 정의되었다. 긍정적 인 반응이 기록되었을 때 다음 약한 필라멘트가 적용되고, 부정적인 응답이 관찰 된 경우, 다음 강한 필라멘트가 적용되었습니다.
- 설명 실험과 방법론은 검토 및 승인 노스 웨스턴 대학 동물 의료 의해위원회를 사용하고 있습니다.
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결과
우리는 세균 감염시 만성 통증의 존재에 대한 NOD / ShiLtj와 C57BL/6J 수컷 쥐를 조사했다. 남성 마우스 (5~7주 이전)은 요도 (그림 1)에 생리 나 세균과 배우는되었습니다. 생리 - 배우는 C57BL/6J 마우스와 UPEC에 감염된 C57BL/6J 마우스의 폰 프라이의 필라멘트와 골반 지역의 기계적 자극이 실험의 28 일 코스 (그림 1) 동안 변경되지 않은 응답 주파수하게되었습니다. 반면, UPEC에 감염된 NOD 마우스는 상당히 큰있었습니다 골반 자극에 반응을 전시 일 28 일 (P <0.05, 그림 3)까지 크게 상승 있었다. 세균 감염 뒷다리 앞발로 땅을 차다 (데이터 미도시)의 발바닥 지역의 촉각 감도의 변경 사항 없음있었습니다.
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토론
UPEC와 마우스 전립선의 감염은 세균 prostatitis, CP / CPPS의 pathogenesis 또는 만성 염증에 predisposing 이벤트로 참여 할 수 있습니다 이벤트의 생체 모델링에서 할 수 있습니다. 방법은 여성 비뇨기의 요로 감염이 7,14에 UPEC 모델에 문학의 큰 몸에 세균 준비 및 떨어 뜨림 조 추첨에 대해 설명했다. 모델은 잠재적 인 백신 후보와 면역 변조의 메커니즘을 테스트 pathogenesis을 공부에 대한 폭 넓은 적용이 있습니다. 객관적 방식으로 통증이 동작을 수행 할 수있는 능력은 감염 유발 통증 pathogenesis 연구와 잠재적으로 고통 치료학을 제작하고 테스트하기위한 잠복기 모델로 할 수 있습니다.
마우스 감염 모델의 성공을 결정하는 중요한 단계가 있습니다. 진동 및 정적 문화와 3 일 문화 방법은 UPEC에 중요하다고 알려져있다 pili 최적의 표현을 위해 수행됩니다상피 세포에 부착. 이 U...
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공개 사항
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감사의 글
이 연구는 NIH / NIDDK에서 부여 1K01DK079019A2 (PT)에 의해 지원되었다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 시약의 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | |
| 문화 튜브 | BD 팔콘 | 352059 | |
| LB 국물 밀러 | EMD | EM1.10285.0500 | |
| Nalgene의 원심 분리기 튜브 | 열 | 3118-0050 | |
| Isoflurane | 버틀러 Schein | NDC 11695-6776-1 | |
| 카테 테르 바늘 30g의 | 해밀턴 | 91,030 | |
| PE10 튜브 | BD intramedic | 427400 | |
| 본 프라이의 필라멘트 | Stoelting | 58025-31 |
참고문헌
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