RNA 전체 마운트하는 방법을 결합하여 현장에서 하이브리드 및 조직학은 유전자 발현은 개발 배아에서 세포 운명 결정과 연결 할 수 있습니다. 이 방법은 해양 elasmobranchs에 적응하고 생물 의학, 독성학 및 비교 연구를위한 모델 생물 이러한 동물의 사용을 촉진하고 있습니다.
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이 논문에서
요약
초록
그들은 적응 면역을 가지고 osmoregulation 1-3에 대해 고유 한 메커니즘이 할 수있는 가장 원시적 인 vertebrates만큼 해양 elasmobranchs는 생물 의학 및 게놈 연구에 대한 동물 모델을 가치입니다. 페어링 된 부속과 함께 가장 원시적 인 생활 jawed - vertebrates으로 elasmobranchs 특히 진화 및 개발에 연구를 들어, evolutionarily 중요한 모델입니다. 해양 elasmobranchs는 기후 변화 4 관계에 수산물 독극물과 스트레스 생리학을 연구하는 데 사용되었습니다. 따라서, 방법론의 발전과 적응을 용이하게하고 여러 생물 분야에 이러한 원시적 인 vertebrates의 사용을 확대 할 필요합니다. 난 여기 원위치 하이브리드 화와 유전자 발현과 elasmobranchs의 세포 조직학을 연구하는 조직 학적 기술에 RNA 전체 마운트의 성공적인 적응을 제시한다.
유전자 발현을 모니터링하는 것은 발달 biol의 특징 도구입니다ogists, 널리 발달 과정, 5를 조사하는 데 사용됩니다. 현장 하이브리드 화의 RNA 전체 마운트는 개발 배아의 조직의 시각화 및 특정 유전자 성적의 국산화 할 수 있습니다. 유전자의 메시지의 표현 패턴은 개발 프로세스와 세포 운명 결정 유전자가 제어 할 수 있습니다 무엇에 대한 통찰력을 제공 할 수 있습니다. 다른 발달 단계에서 유전자의 표현 패턴을 비교하여 통찰력은 개발 중에 유전자의 변화가 어떻게 역할을 습득 할 수 있습니다.
현장 's의 전체 마운트가 조직에 유전자 발현을 지역화 할 수있는 수단을 제공하지만, 조직 학적 기술은 차별화 된 세포 유형과 조직의 식별을 위해 수 있습니다. 조직 학적 얼룩은 다양한 기능을 가지고 있습니다. 일반 얼룩은 세포 형태를 강조하는 데 사용, 예를 들어 각각 hematoxylin 및 핵 및 세포질의 일반적인 착색을위한 eosin. 아르 다른 얼룩은 특정 셀을 강조 표시 할 수 있습니다유형입니다. 예를 들어, alcian 파란색은 mucosaccharides을 식별 할 널리 사용되는 양이온 얼룩은이 논문에서보고 청바지. alcian 푸른 색으로 소화 기관의 얼룩은 mucosaccharides을 생산 블렛 세포의 분포를 확인할 수 있습니다. 짧은 펩티드에 mucosaccharide 성분의 변화는 소화 기관 6 안에서 함수에 의해 블렛 셀을 구분합니다. 동시에 현장 's와 histochemical 방법으로 RNA 전체 마운트를 사용하여, 세포 운명의 결정은 유전자 특정 표현에 연결 할 수 있습니다.
RNA는 현장의와 histochemistry에 널리 연구자들에 의해 사용되고 있지만, 해양 elasmobranchs에서의 적응과 사용이 제한하고 다양한 성공을 충족시켜 왔습니다. 난 여기 elasmobranchs 개발과 연구소에서 정기적으로 사용하는 프로토콜을 제시한다. 현장의 하이브리드 방식의 RNA의 추가 수정이 종에 적응하기 위해 필요한 수 있지만, 프로토콜은 여기 P를 설명그들의 과학적인 문의에 해양 elasmobranchs의 사용을 적응하고자 연구자에 대한 강력한 출발점이 rovide.
프로토콜
해양 Elasmobranchs의 현장 하이브리드 화에 I. RNA 전체 산
1. 배아 고정 및 준비
- 스케이트 배아는 발라드 7에 따라 조작 할 수 있습니다. 유전자 표현의 탐지를위한 최적의 단계는 관심의 조직에 따라 달라집니다. 스케이트 소화 기관에서 유전자 발현을 추적하려면, 단계 7월 27일에서 30일까지 최적입니다.
- 난황 주머니에서 배아를 분리, PBS로 태아를 해부.
- 4에 50 ML 원뿔 튜브 ° C 부드럽게 흔들와의 갓 만든 4 % paraformaldehyde (PFA)의 30 ML에 수정합니다. 24 시간 수정.
- 두 번 실온에서 회전 15 분을 위해, PBT에서 배아를 씻으십시오. 현장 's의 RNA 전체 마운트에 대한 모든 솔루션 조리법은 (표 1)가 포함되어 있습니다.
- 상온에서 PBT 락 : 메탄올의 25 % 시리즈 50 %와 75 % 메탄올에 세척하여 배아를 탈수. 세차의 기간은 태아의 무대에 따라 달라집니다. 사전-N의 경우eurulation이 배아를 개최, 메탄올 시리즈의 각 세척을 5 분이면 충분합니다. 단계....
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결과
L.의 여러 지역에서 alcian 푸른 색 착색의 예 erinacea의 소화 기관은 그림 2에 표시됩니다. globlet 세포를 포함하는 산성 점액은 소화 기관을 통해 얼룩 alcian 파란색으로 명확하게 볼 수 있습니다. 산 mucins의 배포 따라서 기능의 차이를 반영, 소화 기관의 다른 지역에서 다릅니다. 산 mucins의 높은 농도는 말초 장 (2B와 그림 2a 및 2C을 비교)에 감지하는 동안 산성 mucins는 띄엄 띄엄, 나선 장과 배설강에서 생산하고 있습니다.
| PBT | 1 개 PBS |
| 0.1 % 십대 초반-20 | |
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토론
제시 프로토콜은 유전자 발현을 모니터링하고 차별화 된 세포 유형을 식별하기 위해 고전 방법이며, 해양 elasmobranchs에서 사용에 맞게 조정되었습니다. 이러한 프로토콜의 추가 수정이 다른 elasmobranch 종에 적응하기 위해 필요한 수 있습니다.
현장 's의 RNA 전체 마운트에 대한 가장 일반적인 문제는 RNase 오염의 위험함으로써 RNA 프로브 및 내생 메시지의 저하입니다. 두 측면이 고려 될 필요가 : riboprobe의 합성 및 하이브리드 배아 메시지와 RNA를 처리하기위한 일반적인 기법입니다. 일반적으로 ribonucleases에 의한 오염 열지 않은 용기에서 plasticware를 사용하여 피할 수 있으며, 이전에 사용하지 않은 유리 할 수 있습니다. 새로운 유리를 사용할 수없는 경우, RNase - 멀리 (VWR # 17810-491)으로 모든 유리를 취급합니다. 세차는 부드럽게 구멍 스푼을 통해 솔루션을 주입하고 유리 병.......
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공개 사항
나는 공개 할 아무 것도 없습니다.
감사의 글
내 연구실에 근무하고 이러한 프로토콜의 발전에 공헌 한 많은 학부 학생을 감사하고 싶습니다. NAT는 Skidmore - 연합 네트워크 교부금을 지불 NSF 사전으로 설립 프로젝트에서 지원을 받았습니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 10 x 전사 완충액 | Roche | 11-465-384-001 | |
| DIG-RNA 라벨링 믹스 | Roche | 11-277-073-910 | |
| RNAse inhibitor | Roche | 03-335-399-001 | |
| RNA 중합효소 - SP6 | Roche | 10-810-274-001 | |
| DNAseI, RNAse-free | Roche | 10-776-785-001 | |
| 효모 RNA | Invitrogen | 15401-029 | |
| CHAPS | EMD-Millipore | 220201 | |
| 헤파린 | Sigma-Aldrich | H4784 | |
| DEPC(디에틸 피로카보네이트) | Research Organics | 2106D | |
| Moria Perforated Spoon | Fine Science Tools | 10370-17 | |
| Netwell inserts | Electron Microscopy Sciences | 64713-00 | 6웰 조직 배양 접시에 사용되는 넷웰 |
| 6웰 조직 배양 플레이트 | Corning | 3516 | |
| 나사 캡 뚜껑이 있는 유리 섬광 바이알 | Weaton Science Products | 986540 | |
| 포름아미드 | Fisher | BP227500 | |
| Proteinase K | Invitrogen | 59895 (AM2542) | |
| NBT | 11585029001 | ||
| BCIP | Roche | 11585002001 | |
| 과산화수소, 30% | EMD | HX0635-1 | |
| 양 혈청 | VWR | 101301-478 | |
| 글루타르알데히드 | Sigma-Aldrich | G5882 | |
| tRNA | Roche | 10-109-541-001 | |
| Anti-DIG Fab Fragments | Roche | 1137-6623 | |
| 표 3. RNA 전체 마운트in situ's용 시약 및 장비. | |||
| 1% Alcian Blue 8GS, pH 2.5 | 전자 현미경 과학 | 26323-01 | |
| 핵 고속 적색 | 전자 현미경 과학 | 26078-05 | |
| DPX 탑재 | 전자 현미경 과학 | 13510 | |
| 파라핀(파라플라스트 X-tra) | McCormick Scientific | 39503002 | |
| 10% 포르말린, NBF | VWR | 95042-908 | |
| 스크류 캡 뚜껑이 있는 유리 섬광 바이알 | Weaton Science Products | 986540 | |
| 스테인리스 스틸 베이스 몰드 | Tissue-Tek | 4161-4165 | 다양한 크기 사용 가능. |
| 카세트 | Tissue-Tek | 4170 | |
| 슬라이드 워머 | Fisher-Scientific | 12-594Q | |
| 조직 임베더 | Leica Microsystems | EG1160 | |
| Microtome, 로터리 | Leica Microsystems | RM2235 | |
| Tissue-Tek 슬라이드 염색 세트 | 전자 현미경 과학 | 62540-01 | |
| Tissue-Tek 24-Slide 홀더 | 전자 현미경 과학 | 62543-06 | |
| Superfrost*Plus 슬라이드 | Fisherbrand | 12-550-17 | |
| 표 4. Alcian Blue stain용 시약 및 장비. |
참고문헌
- Forester, R., Goldstein, L. Intracellular osmoregulatory role of amino acids and urea in marine elasmobranchs. Am. J. Physiol. 230, 925-931 (1976).
- Shuttleworth, T. Physiology of elasmobranch fishes. Shuttleworth, R. , Springer-Verlag. 171-194 (1988).
- Yancey, P. H., Clark, M. E., Hand,....
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