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방법 논문

미생물 시스템 생물학의 Chemostats의 사용

30.9K 조회수

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DOI:

10.3791/50168

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2013년 10월 14일

이 논문에서

요약

세포의 성장 속도는 규제 과정 및 세포 생리학의 주요 결정 요인이다. chemostats를 이용한 연속 배양은 세포 성장과 이러한 네트워크는 세포 성장을 최적화하기 위해 발전을 제어하는​​ 분자 네트워크의 학습을 용이 영양소 한정하여 세포 성장 속도의 외인성 제어를 가능하게한다.

초록

세포는 외부 세계로부터의 신호에 응답하여 자신의 성장의 속도를 조절한다. 세포가 성장함에 따라, 다양한 세포 과정은 고분자 합성, 신진 대사와 세포 분열주기에 궁극적으로 책임 등 조정해야합니다. chemostat 실험적으로 세포의 성장 속도를 제어하는​​ 방법은, 체계적 연구의 강력한 수단을 제공하는 방법 성장률​​ 영향 세포 과정 - 세포의 성장 속도를 제어 규제 네트워크 - 유전자 발현 및 대사 등. 세대 chemostats 수백 유지하면 세포 성장을 제한하는 환경 조건에서 미생물의 적응 적 진화를 연구하기 위해 사용될 수있다. 우리는 chemostat 문화의 원리를 설명하는 자신의 작업을 설명하고 그들의 다양한 응용 프로그램의 예를 제공합니다. 20 세기 중반에 소개 된 후 폐기의 기간을 다음과 게놈 규모의 방법론의 융합은 리뉴얼의 terest 세포의 성장과 적응 진화의 분자 기준의 규정에 생물학 연구에 chemostats의 사용에 르네상스를 자극한다.

서론

세포의 성장은 유전과 환경 요인의 1,2 상호 작용의 복잡한 네트워크에 의해 조절된다. 세포 성장의 인성 규정은 그 연구에 대한 시스템 레벨 접근을 필요로한다. 그러나, 조절 된 세포 성장의 엄격한 실험적 연구는 세포가 성장하는 속도를 제어하는​​ 어려움에 의해 도전된다. 또한, 가장 간단한 실험에서 세포 외 조건은 그들이 증식과 세포가 지속적으로 환경을 변경 자주 역동적이고 복잡하다. 정의 불변 및 제어 환경에서 세포 성장률 실험 제어를 가능하게 세포를 배양하는 방법에있어서, 이러한 문제에 대한 해결책은 chemostat에 의해 제공된다.

chemostat를 사용하여 연속 배양하는 방법은 독립적으로 1950 년에 모 노드 3 노빅 & Szilard 4에 의해 설명되었다. 원래 생각으로, 세포는 사기꾼 미디어의 고정 된 볼륨에서 재배되는tinually 새로운 미디어 및 기존 미디어와 세포의 동시 제거 (그림 1)을 첨가하여 희석. 결합 상미 분 방정식 (도 2) 세포 밀도 (x)와 chemostat 용기에서 성장 제한 영양소 (들)의 농도의 변화율을 설명한다. 중요한 사실은, 방정식이 시스....

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프로토콜

chemostat를 이용한 연속 배양의 원리는 다양한 구현으로 구현 될 수있다. 모든 chemostats에서는 모든 구성 요소의 무균 상태를 유지하기위한 1) 방법을 가지고하는 것이 필수적입니다, 2) 잘 혼합 된 문화, 배양 용기의 3) 적절한 통풍 및 미디어뿐만 아니라 문화의 제거 4) 신뢰할 수있는 수단. 여기, 우리는 쉽게 다른 설정에 적용 할 수있는 방법을 사용하여 chemostat로 Sixfors 생물 반응기 (Infors 병원)의 사용을 설명합니다.

1. Chemostat 용기를 조립

  1. 메인 스위치를 사용하여 Sixfors를 켭니다.
  2. 철저히 chemostat 용기, 교반기 어셈블리, 탈 (DI) 물 부착 된 튜브를 씻어. 모든 배관 및 O-링을 점검하고보고 마모 조각을 교체합니다.
  3. 구동축의지지 기반은 유리 용기에 드라이브 샤프트의 상단은 교반기 어셈블리의 하우징에 물리도록 위로 향하게되어 있는지 확인합니다. stirre을 설정구동축의 하단을 보장 유리기에 R 조립체는 구동축지지 장착된다. 유리 용기에 교반기 어셈블리를 고정하는 클램프를 사용합니다.
  4. DI 물 약 300 ㎖로 배를 채우십시오.
  5. 프로브 (2 할) 및 하단 케....

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결과

chemostats의 주요 장점은 희석 비율을 변화시킴으로써 실험적 세포의 성장 속도를 제어 할 수있는 능력이다. 출아 효모, 사카로 마이 세스 세레 비시 애, 세포의 형태는 세포 분열주기에서의 위상이 유익하다. 높은 성장률과 인구 unbudded 세포의 비율 (그림 5A)을 측정하여 결정 적극적으로 세포를 분할하는 높은 비율을 포함한다. chemostat 문화의 글로벌 mRNA 발현의 분석은 많은 유전자의 발현이 차등 성장률 (그림 (b)와 그림 5C)의 함수로 표현되는 것으로 나타났습니다.

상이한 유전자형의 상대적인 적합성이 형광 표지 된 세포를 사용 chemostats 경쟁 어 세이를 수행함으로써 결정 계측법 분석 (도 6a)를 흐르게 할 수있다.도 6b는 변이주가 COM시킨 대표적인 결과를 나타낸다 찬란 태그 야생형 균주에 대해 peted.......

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토론

Chemostats 성장 제어 정상 상태 조건에서 미생물의 배양을 가능하게한다. 세포는 고정 외부 환경의 결과로 일정한 속도로 연속적으로 성장한다. 이것은 외부 환경이 지속적으로 변화하고 세포 성장의 레이트가 환경이나 유전자형의 복잡한 상호 작용에 의해 결정되는 회분식 배양 방법과 대조적이다. 따라서, 배치 배양 위에 chemostats에서 미생물을 배양의 주요 장점은 실험적으로 세포의 성장 속도를 제어 할 수있는 능력이다.

세포가 성장하는 속도는 영양 감지, 신호 전달, 고분자 합성과 대사 등의 무수한 세포 프로세스 사이의 상호 작용의 결과이다. 글로벌 분석 방법과 함께 chemostats를 사용하여 수의 조사 방법 세포가 조절과 함께 휴대 과정을 조정하는 방법을 반대로 성장에 미치는 영향의 속도는 기본 셀의 프로세스와성장의 속도. 야생형 세포 연구는 RNA와 단백질의 세포 농도는 뿌리깊은 세포의 성장 6의 비율에 의해 영향을받는 등 최근이 사체

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공개 사항

저자는 더 경쟁 재정적 이익이 없다는 것을 선언합니다.

감사의 글

이 작품은 자금이 뉴욕 대학을 형성하기 시작에 의해 지원되었다. 우리는 처음에 chemostats로 Sixfors 생물 반응기의 사용을 개발 미륵 던햄와 매트 브라우어 감사합니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
Infors-HT Sixfors Chemostat적절한 기술 리소스, Inc. 
유리 병 9.5 LFisher Scientific02-887-1미디어 용기 및 호스 Fisher
Scientific05-867미디어 용기 및 호스
스토퍼, 크기 12, 그린 네오프렌Cole-PalmerEW-62991-42미디어 용기 및 호스 스트레이트
커넥터Cole-PalmerEW-30703-02미디어 용기 및 호스 일반
목적 타이 4 inFisher ScientificNC9557052미디어 용기 및 호스
튜빙, 실리콘 고무소형 부품B000FMWTDE미디어 용기 및 호스
튜빙, 실리콘, 3/8 인치 ODFisher Scientific02-587-1Q미디어 용기 및 호스
튜빙, 실리콘, 7/32 인치 ODFisher Scientific02-587-1E미디어 용기 및 호스 용
튜빙, 스테인리스 스틸, 3/16 인치 ODMcMaster-Carr6100K164미디어 용기 및 호스
튜빙, 스테인리스 스틸, 3/8 인치 ODMcMaster-Carr6100K161미디어 용기 및 호스 후크
커넥터Fisher Scientific14-66-18Q미디어 용기 및 호스 래
칫 클램프Cole-PalmerEW-06403-11미디어 용기 및 호스
루어용, 미디어용기 및 HosingCole-PalmerEW-45512-34
남성Cole-PalmerEW-45513-04
; mFisher ScientificMTGR05010For Media Vessel and Hosing
PTFE Acrodisc CR 13 mm 필터, 0.2 μ mFisher ScientificNC9131037미디어 용기 및 호스 직접
판독 유량 튜브 공기Cole-PalmerEW-32047-77질소 가스 설정
직접 판독 유량 튜브Cole-PalmerEW-32048-63질소 가스 설정
가스 비례 장치 다중 튜브 프레임Cole-PalmerEW-03218-50질소 가스 설정
레귤레이터,질소 가스 설정
어댑터, 스테인리스 스틸AirgasY99-26450, 질소 가스 설정
호스 남성 어댑터AirgasWES544질소 가스 설정용
Norprene TubingUS Plastics57280질소 가스 설정
삼각대 베이스Cole-PalmerEW-03218-58질소 가스 설정
밸브 카트리지Cole-PalmerEW-03217-92질소 가스 설정
Carboy 10 LFisher Scientific02-963-2A미디어 준비
Steritop 멸균 진공 병 상단 필터, 1,000 ml, PES 멤브레인; 45mm 목 크기Fisher ScientificSCGP-T10-RE미디어 준비
미디어 병 100ml, 45mm 목 크기Fisher ScientificFB-800-100미디어 준비
칼슘 클로라이드 &미드도트; 2H2OFisher ScientificC79-500미디어 시약
염화나트륨Fisher ScientificBP358-1미디어 시약
마그네슘 황산염&미드도트; 7H2O시그마 알드리치230391배지 시약
인산칼륨 일염기성 Fisher ScientificAC424205000배지 시약
황산암모늄 FisherScientificAC423400010배지 시약
염화칼시그마 알드리치P9541배지 시약
붕산시그마 알드리치B6768미디어 시약
구리 설페이트 및 미드 도트; 5H2O시그마 Aldrich209198배지 시약
요오드화 칼시그마 Aldrich60400미디어 시약
염화철 및 중점; 6H2OFisher ScientificI88-100미디어 시약
황산 망간 및 미드닷; H2OSigma Aldrich230391미디어 시약
나트륨 몰리브덴산염&미드닷; 2H2OSigma AldrichM7634미디어 시약
황산아연 및 미드도트; 7H2OFisher ScientificZ68-500배지 시약
비오틴Fisher ScientificBP232-1배지 시약
판토텐산 칼슘Fisher ScientificAC24330-1000배지 시약
엽산Sigma AldrichF7876배지 시약
이노시톨(일명 myo-inositol)Fisher ScientificAC12226-1000배지 시약
니아신(일명 니코틴산)Sigma AldrichN4126배지 시약
p-아미노벤조산Fisher ScientificAC14621-2500배지 시약
피리독신 HCl시그마 AldrichP9755배지 시약
리보플라빈Sigma AldrichR4500-25G배지 시약
티아민 HClFisher ScientificBP892-100배지 시약
류신시그마 AldrichL8000-100G배지 시약
UracilSigma AldrichU0750배지 시약
포도당Fisher ScientificDF0155-08-5배지 시약
용 Luer용 여성 , 미디어 용기 및 Hosing Millipore Aervent MTGR05010 62mm 필터, 0.2 &mu용 용 호스 N145D580, 륨 륨

참고문헌

  1. Ingraham, J. L., Maaloe, O., Neidhardt, F. C. Growth of the Bacterial Cell. , Sinauer Associates, Inc. (1983).
  2. Cell Growth: Control of Cell Size. Hall, M. N., Raff, M. C., Thomas, G. , CSHL Press. (2004).
  3. Monod, J. La technique de culture continue, theorie et applications. Ann. Inst. Pasteur. 79, 390-410 (1950).
  4. <....

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