방법 논문

요리사 tdTomato를 사용하여 Zebrafish Somatosensory의 뉴런의 Optogenetic 활성화

DOI:

10.3791/50184

⸱

2013년 1월 31일

 , 
1Department of Molecular, Cell, and Developmental Biology, University of California, Los Angeles

이 논문에서

요약

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Optogenetic 기법은 가능한 행동에 특정 뉴런의 공헌을 공부 만들었습니다. 우리는 다이오드 펌핑 고체 상태 (DPSS) 레이저 channelrhodopsin 변형 (요리사)를 표현하고 고속 비디오 카메라로 elicited 행동을 녹화 한 somatosensory 뉴런을 활성화하기위한 애벌레의 zebrafish의 방법을 설명합니다.

초록

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애벌레의의 zebrafish는 간단 신경 회로의 개발과 기능을 설명하기위한 모델로 등장하고 있습니다. 외부 기름지게, 신속한 개발 및 투명도로 인해 zebrafish는 특히 신경 회로 기능을 조사 optogenetic 접근 방식에 적합합니다. 이 방법에서는 빛에 민감한 이온 채널이 활성화하거나 억제를 마음대로하기 때문에 특정 행동에 대한 그들의 공헌을 평가하는 실험을 사용, 특정 뉴런에서 표현됩니다. 애벌레의 zebrafish에서 이러한 방법을 적용하는 것은 개념적으로 간단하지만 기술적 인 세부의 최적화가 필요합니다. 여기 애벌레의 zebrafish somatosensory의 뉴런, 사진 활성화 한 셀에 channelrhodopsin의 변형을 표현하고 그 결과 행동을 기록하기위한 절차를 보여줍니다. 이전에 설정 한 방법에 몇 가지 수정을 도입함으로써,이 방식은 최대 활성화 한 뉴런에서 행동 반응을 유도하는 데 사용할 수 있습니다최소 4 일 후 수정을 (dpf). 특히, 우리는 태그 channelrhodopsin 변형, 요리사 tdTomato의 표현을 유도 할 somatosensory 신경 세포 증강, CREST3를 사용하여 transgene을 만들었습니다. 공 촛점 현미경으로 이미징 할 수 있습니다 somatosensory 뉴런의 모자이크 표현, 1 세포 단계의 배아 결과에이 transgene를 주입. 조명은 473 nm의 DPSS 레이저의 빛이 동물에서 세포를 식별 광섬유 케이블을 통해 안내, 고속 비디오 카메라로 기록하고 양적 분석 할 수 동작을 elicits. 이 기술은 모든 zebrafish의 신경 세포를 활성화하여 elicited 학습 행동에 적용 할 수 있습니다. 유전자 또는 약리 섭동으로이 방법을 결합하면 회로 형성 및 기능을 조사 할 수있는 강력한 방법이 될 것입니다.

서론

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빛의 정의 파장과 neuronal 흥분을 광고하거나 억제를위한 optogenetic 방법의 개발은 가능한 행동을 1, 19, 21 제어 신경 회로의 뉴런의 뚜렷한 인구의 기능을 공부 만들었습니다. 이 기술은 종종 뉴런의 그룹을 활성화하는 데 사용됩니다,하지만 또한 개별 뉴런을 활성화하는 데 사용할 수 있습니다. 그들은 반투명 때문에 Zebrafish 애벌레 이러한 방법으로 특히 의무가 있으며, 자신의 신경 시스템은 신속하게 개발하고, 유전자 변형 동물을 만드는 것은 빠르고 일상입니다. 그러나, 중요한 기술적 장애물이 안정적으로 하나의 신경 세포 활성화를 달성하기 극복해야합니다.

한 zebrafish의 뉴런의 optogenetic 활성화를위한 절차를 최적화하기 위해, 우리는 somatosensory 뉴런에 집중했다. 머리를 신경을 분포시키다 삼차 뉴런, 그리고 Rohon-비어드 (: Zebrafish의 애벌레는 두 뉴런의 인구를 사용하여 somatosensory 자극의 다양한 감지몸의 나머지 부분을 신경을 분포시키다 RB) 뉴런. 각 삼차와 RB 신경 세포는 피부에 광범위하게 가지 자극 및 다운 스트림 신경 회로에 연결 중심 축삭을 감지 할 수있는 주변 축삭을 계획했다. 동물은 코 히어 런트 somatosensory

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프로토콜

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미리 다음 사항을 준비합니다.

1. 광 케이블을 준비

  1. ~ 150 ° 각도를 만드는 분젠 버너 위에 유리 파스퇴르 피펫의 테이퍼 목을 용해하여 광 케이블을위한 저장 장치를 만들 수 있습니다.
  2. 와이어 커터 또는 면도날을 사용하여 조심스럽게 두 가지로 광 케이블을 잘라. 각 태그는 FC / PC 어댑터 한 노출 끝으로 한쪽 끝이 있어야합니다. 예비 케이블로 한 조각을 저장합니다.
  3. 케이블의 절단 끝의 5.0 cm에서 섬유 재킷과 강화 섬유 (그림 1A)를 제거하여 cladding에 광 케이블을 제거합니다.
  4. 준비된 파스퇴르 피펫으로 광 케이블을 삽입합니다. 케이블이 쉽게 피펫 팁에 들고 이동할 수 있는지 확인하십시오.
  5. 광 케이블 신중하게 유리 섬유 각국에서 섬유 cladding을 잘라 제거, 파스퇴르 피펫의 끝에서 튀어으로, 잘라 내기 끝에서 ~ 2mm.
  6. 닉 ㅇ 해제하고, 다이아몬드 펜 / 유리 커터 유리 섬유 사용FF는 끝 섬유 (그림 1B)의 끝 부분에 깨끗한 절단 / 표면을 만들 수 있습니다.
  7. 저장을 위해 파스퇴르 피펫에 광 케이블을 철회. 광섬유의 끝이 u....

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결과

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1 그림. 광 케이블은 설정합니다. 광섬유 케이블의 (A) 레이어. 파스퇴르 피펫의 (B) 사라지고 광섬유 케이블. (C) 파스퇴르 (Pasteur) 피펫의 광섬유 케이블은 micromanipulator를 사용하여 위치.

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그림 2. 사출 금형 템플릿입니다.

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토론

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우리는 라이브 zebrafish의 단일 RB의 뉴런의 optogenetic 활성화를위한 접근 방식을 설명하고 있습니다. 우리의 방법은 특정 somatosensory 뉴런에서 휘황 태그 channelrhodopsin의 변형, 요리사 tdTomato 13, 표현할 수있는 과도 transgenesis을 사용합니다. 이 접근 방식은 쉽게 다른 애벌레의 zebrafish 세포 집단에 사용하기 위해 적용 할 수 있습니다.

이 방법을 사용하여 우리는 지속적으로 요리사 tdTomato을 표현 34-48 hpf의 애벌레에서 행동 반응을 elicited. 5 V에서 푸른 빛의 5 밀리 초 펄스를 사용하여, 우리는 하나의 RB의 뉴런 (그림 7)를 활성화 할 수있었습니다. 동물을 따라 다른 지점에서 광 섬유를 위치함으로써, 우리는 행동 반응을 유도하기 위해 전지 본체에 직접 푸른 빛을 목표로 할 필요가 있다고 발견했습니다. 라이트 펄스는 요리사를.......

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공개 사항

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제작자들은 더 경쟁 금융 관심이 없다는 것을 선언합니다.

감사의 글

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우리는 레이저가 설정 행동 실험과 DPSS에 대한 조언을 Fumi Kubo, 토드 Thiele과 HerwigBaier (UCSF / 최대 플랑크 연구소) 감사, 요리사 tdTomato 실험에 도움을위한 MBL 신경 생물학 과정에서 희수 킴과 키아라 Cerri, PetronellaKettunen (예테보리 (Gothenburg) 대학 ) 초기 optogenetic 실험에 협력, BaljitKhakh, 에릭 허드슨, 마이크, Baca 및 기술 조언 존 Milligan (UCLA) 및 요리사 tdTomato에 대한 로저 Tsien (UCSD) 구성합니다. AS :이 작품은 NSF에서 AMSP와 부여 NRSA (5F31NS064817) 수상 (0,819,010 장비)에 의해 지원되었다.

....

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재료

~ 7.0으로 pH를 조정
장기 저장을위한 4 ° C 또는 -20 ° C에 저장

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
시약 / 재료의 이름 회사 카탈로그 번호 코멘트
자료
유리 파스퇴르 피펫 어부 1367820B 또는 이에 상응하는 페이지 (10-15mm 직경)
200 μm 광섬유 ThorLabs AFS200/220Y-CUSTOM 패치 코드, 길이 : 3m는 최종 A : FC / PC, 종료 B : FC / PC, 재킷 : FT030
50 μm 광섬유 ThorLabs AFS50/125Y-CUSTOM 패치 코드, 길이 : 3m는 최종 A : FC / PC, 종료 B : FC / PC, 재킷 : FT030
조정 깎아 도구 ThorLabs AFS900 또는 3 홀 스트리핑 도구 (FTS4)
다이아몬드 웨지 서기 ThorLabs S90W
/ 브라운 Micropipette 풀러을 불타는 셔터 악기 P-97 또는 동급
필라멘트가있는 붕규산 유리 관 셔터 악기 BF-100-78-10
사출 금형 N / A N / A 그림 5
1.5 ML의 원심 분리기 튜브 어떤 어떤
페트리 접시 (100x15 mm) 어떤 어떤
페트리 접시 (60x15 mm) 어떤 어떤
압력 주입기 ASI MPPI-3 또는 동급
Micromanipulator 및 금속 스탠드 Narashige M152 또는 동급
일회용 플라스틱 피펫 Fisherbrand 13-711-7 또는 동급
포커 (핀 홀더와 곤충 핀) 고급 과학 도구 주식회사 26018-17 및 26000-70 또는 동급
집게 고급 과학 도구 주식회사 11255-20 또는 동급
Microloader 피펫 팁 Eppendorf 9300001007
28.5 ° C 배양기 어떤 어떤
42 ° C 열 블록 어떤 어떤
비 무균 메스 블레이드 # 11 고급 과학 도구 주식회사 10011-00 또는 동급
을 해부대처하다 Zeiss Stemi 또는 동급
표준 필터 형광 해부 범위 어떤 어떤 또는 동급
공 촛점 현미경 Zeiss LSM 510 또는 710 또는 GFP 및 RFP에 대한 레이저와 동등한, 그리고 10 배, 20x 및 40x 목표
고속 카메라 AOS 테크놀로지스 주식회사 X-PRI (130025-10) 또는 동급
473 nm의 휴대용 레이저 크리스탈 레이저 CL-473-050 TTL 옵션을 사용하여 이상 전원,
S48 Stimulator 아스트로 - 메드 주식회사의 잔디 악기 부문 S48K 또는 동급
FC / PC 결합 슬리브에 FC는 / PC ThorLabs ADAFC1 월 NE광 케이블 연결을위한 에드
레이저 안전 안경 ThorLabs LG10 또는 동급
24 문화 판 Genesee 25-102 또는 동급
단일 우울증 슬라이드 어부 S175201 또는 동급
시약
인스턴트 바다 수중 생태계 IS50
메틸렌 블루 어부 S71325
페놀 레드 시그마 P4758
아가로 오스 EMD 2125 또는 동급
낮은 용융 아가로 오스 시그마 A9045 또는 동급
PTU 시그마 P7629
Tricaine 시그마 A5040
블루 / 배아 물 10 L ddH 2 O
0.6 g 인스턴트 오션
6 물방울 메틸렌 블루
페놀 레드 (0.2 M KCl 5 MG / ML)
100x PTU 0.150 g PTU
50 ML ddH 2 O
70에 용해 ° C, 자주 흔들
-20 ° C에서 나누어지는 및 매장
1X PTU 한 ML 100x PTU
99 ML 블루 / 생선 물
Tricaine 재고 솔루션 400 밀리그램 tricaine
97.9 ddH 2 O
~ 2.1 ML 1M 트리스, pH9.0

참고문헌

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Arrenberg, A. B., Del Bene, F., Baier, H. Optical control of zebrafish behavior with halorhodopsin. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106 (42), 17968-17973 (2009).
  2. Burgess, H. A., Johnson, S. L., Granato, M. Unidirectional start....

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태그

ChEF tdTomatoCREST3

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