대형 식별 뉴런 (과 동물 예 mollusks), 모터 풀의 분석은 세포 기술을 사용하여 수행됩니다 1,2,3,4. 최근, 우리는 extracellularly에서 개별 뉴런을 자극하고 기록 할 수있는 기술을 개발 Aplysia californica 5. 이제 우리는 고유 식별하고 모터 수영장에서 모터 뉴런을 특성화하기 위해이 기술을 사용하기위한 프로토콜을 설명합니다.
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이 논문에서
요약
초록
대형 식별 뉴런 (예 : mollusks), 모터 풀의 분석과 동물에서 세포 기술에게 1,2,3,4를 사용하여 수행됩니다. 최근, 우리는 extracellularly 자극하고 Aplysia californica 5 개별 뉴런을 기록 할 수있는 기술을 개발했습니다. 이제 우리는 고유 식별하고 모터 수영장에서 모터 뉴런을 특성화하기 위해이 기술을 사용하기위한 프로토콜을 설명합니다.
이 세포 기술은 장점이 있습니다. 첫째, 세포 전극은 자극하고 기록 뉴런을 피복 1-5하므로 제거 할 필요가 없습니다 수 있습니다. 따라서, 뉴런은 세포들보다 세포 실험에서 건강하게 될 것입니다. 둘째, 신경절 경우하면 집에 걸어주는 적절한하여 회전은, 세포 전극은 쉽고 효율적으로 같은 준비에서 여러 뉴런을 식별 할 수 신경절의 양쪽 뉴런에 액세스 할 수 있습니다. 셋째, extracellu고맙다 전극은 세포를 통과 할 필요가 없습니다, 그래서 쉽게 그들에게 더 적은 손상을 초래 뉴런 사이에 앞뒤로 이동할 수 있습니다. 하나가 단 몇 분 거리에 지속될 수 있습니다 모터 패턴을 반복하는 동안 여러 뉴런을 기록하려고 할 때 특히 유용합니다. 넷째, 세포 전극은 근육 운동 기간 동안 세포들보다 더 유연합니다. 세포 내 전극 꺼내 근육 수축 동안 뉴런가 손상 될 수 있습니다. 세포 전극이 부드럽게 뉴런 위의 집에 눌러되므로 대조적으로, 그들은 일반적으로 근육의 수축시 동일한 뉴런 위 유지, 따라서 더 많은 손상 준비에 사용할 수 있습니다.
소마 크기와 위치, axonal 프로젝션, 그리고 근육 innervation 4 : 고유 세포 전극을 사용하여 모터 풀 (특히, Aplysia의 I1/I3 근육)에 모터 뉴런을 식별하려면, 하나는 기준으로 세포 측정을 필요로하지 않는 기능을 사용할 수 있습니다, 6,7. 기술을 설명하는 데 사용되는 특정 모터 풀의 경우, 우리는 axonal 예측을 측정하기 위해 구강 신경에서 2, 3를 기록하고, 각각의 모터 뉴런에 근육 innervation의 패턴을 결정하기 위해 I1/I3 근육의 수축 힘을 측정.
우리는 빠른 식별을위한 단순화 된 진단 방법을 만들어, 모터 패턴 중에 타이밍을 특성화, 근육 innervation을 사용하여 첫번째 식별 모터 뉴런의 전체 과정을 보여줍니다. 간체 및 더 빠른 진단 방법은 정지 구강 대량 준비 8 또는 생체 9 예를 들어, 더 많은 손상 준비를위한 우수합니다. 이 과정은 2,3,13,14 Aplysia 또는 다른 동물 시스템에서 10,11,12 다른 모터 수영장에서 적용 할 수 있습니다.
프로토콜
1. 녹화 요리의 작성
- 힘 변환기 실험 기간 동안, 구강 신경절, 뇌성 신경절 및 구강 질량 힘 연구에 대한 전문되는 원형 Pyrex 요리에 배치되어 있습니다.
- 실험에 ingestive 같은 패턴을 유도하기 위해, 우리는 대뇌 신경 15 비 hydrolyzable cholinergic 작용제의 carbachol를 적용해야합니다. 구강 신경절 및 구강 대량 위에 carbachol의 직접 접촉을 방지하기 위해, 별도의 챔버는 구강 신경절 및 구강 질량 (그림 1)에서 대뇌 신경을 분리하기 위해 필요합니다.
- 구강 대량의 구강 신경절보다 훨씬 두꺼운이기 때문에, 그것들은 동일한 수준에 배치되지 않습니다. 따라서,이 요리는 (지역 D에 (지역 그림 1 A) 구강 신경절 (그림 1의 영역 C) 및 구강 대량의 더 깊은 프런트 챔버의 중앙 플랫폼을 대뇌 신경에 다시 챔버가 있어야합니다 그림 1).
- 이 요리를 만들려면, 원형 100x15 Pyrex 요리 (높은 15mm, 직경 100 ㎜)로 시작합니다. 요리의 건설은 몇 가지가 Sylgard의 따를 필요합니다. Sylgard 제품과 함께 제공된 지침을 따....
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결과
그림 4와 5는 두 I1/I3 모터 뉴런을 식별하는 데 사용되는 일반적인 결과를 보여줍니다. 그림 4 egestive 같은과 ingestive 같은 패턴 (인물 4C, 4D) 동안 대형 모터 뉴런, B3의 소마 녹음을 보여줍니다. 일대일의 소마 채널 및 B3 소마 기록의 특이성이 패턴 동안 유지되었다는 ipsilateral BN2 채널 (그림 4E) 쇼에 해당하는 스파이크. B3는 패턴의 중간 - 투 - 늦은 후퇴 단계에서 발생합니다. 그림 4와 다른 결과 (미도시)에서, 우리는 B3의 BN2 단위는 항상 가장 큰 BN2 단위입니다 것으로 나타났습니다. 따라서, 또한 BN2 녹음에서 직접 감지 할 수 있습니다.
그림 5는 egestive 같은과 ingestive 같은 패턴 (그림 5.......
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토론
예 mollusks (예를 들어, Lymnaea, 나선형, 그리고 Aplysia), 모터 풀의 분석과 같은 대형 식별 뉴런과 동물에서 일반적으로 세포 내 기록 1,2,3,4를 사용하여 수행됩니다. 이 프로토콜에서는, 우리는 고유 세포 기술을 사용하여 모터 풀의 모터 뉴런을 식별하기위한 프로세스에 대해 설명합니다. 우리는이 과정을 그림으로 힘 측정을 사용했습니다. 하나는 또한 근육 innervations를 측정하는 EMG을 사용할 수 있습니다. 간단히 이렇게하려면 프로토콜은 EMG 녹음에 대한 I1/I3 근육의 다른 지역에 훅 전극을 연결하는 변경해야합니다.
세포 기술은 이미 위에서 설명한 된 일부의 세포 기술, 이상 특정 장점이 있습니다. 첫째, 세포 기술은 적은 시간과 실험에 대한 신경절를 준비하는 뉴런에 덜 손상을 발생할 노력이 필요합니다. 보통,이 buc 준비를 20-30 분 소요됩니다세포 실험에 대한 구강 미사에 부착.......
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공개 사항
우리는 공개 할 아무 것도 없습니다.
감사의 글
이 연구는 NIH 보조금 NS047073 및 NSF 보조금 DMS1010434에 의해 지원되었다.
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재료
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| 황산 마그네슘의 heptahydrate | 피셔 과학 | M63 | 인증 ACS |
| 칼슘 염화물 이수화 | 피셔 Scientifc | C79 | 인증 ACS |
| 포도당 (덱스 트로 오스) | 시그마 - 알드리치 | G7528 | BioXtra |
| 걸레는 buffe연구 | Acros의 유기물 | 17,263 | 99% |
| Carbachol | Acros의 유기물 | 10,824 | 99% |
| 수산화 나트륨 | 피셔 과학 | SS255 | 인증 |
| 염산 | 피셔 과학 | SA49 | 인증 |
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참고문헌
- McCrohan, C. R., Benjamin, P. R. Synaptic relationships of the cerebral giant cells with motoneurones in the feeding system of Lymnaea stagnalis. J. Exp. Biol. 85, 169-186 (1980).
- Benjamin, P. R., Rose, R. M. Central gen....
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