이 콘텐츠를 보려면 JoVE 구독이 필요합니다. 로그인하거나 오늘 무료 평가판을 시작하세요.

방법 논문

세포 배양에서 RNA 합성, 처리 및 부패의 높은 해상도 유전자 발현 프로파일에 대한 새로 전사 RNA 대사 라벨링

27K 조회수

⸱

DOI:

10.3791/50195

⸱

2013년 8월 8일

 ,  ,  ,  ,  , 
1Max von Pettenkofer Institute, 2Department of Medicine, University of Cambridge, 3Institute for Informatics, Ludwig-Maximilians-University Munich

* These authors contributed equally

이 논문에서

요약

전체 세포 RN​​A 단기 RNA 합성과 붕괴의 변화뿐만 아니라 RNA 처리 속도론을 연구 가난한 템플릿을 제공합니다. 여기에, 우리는 4 thiouridine에 새로 전사 RNA의 대사 라벨을 설명하는 이러한 한계를 극복 할 수 있도록 새로 전사 RNA의 싸이 특정 biotinylation 및 정제에 의해 따랐다.

초록

전체 - 사체 마이크로 어레이 차세대 시퀀싱의 개발은 세포의 유전자 발현의 복잡성에 대한 우리의 이해를 혁명하고 있습니다. 참여 분자 메커니즘에 대한 이해와 함께, 기본 역학의 정확한 측정은 점점 중요 해지고있다. 여기에 이러한 강력한 방법론 템플릿 샘플들이 연구 즉, 전체 세포 RNA의 고유 특성으로 인해 주요 한계에 직면하고 있습니다. 대부분의 경우 전체 세포 RN​​A의 변화는 충분한 해상도를 기본 분자 사건과 반응 속도를 나타내는 하나 너무 느리게 혹은 너무 빨리 발생합니다. 또한, RNA 합성, 처리 및 부패의 변화의 기여도는 쉽게 구별되지 않습니다.

우리는 최근 이러한 한계를 극복하기 위해 고해상도 유전자 발현 프로파일을 개발했습니다. 우리의 접근 방식은 4 thiouri에 새로 전사 RNA의 대사 라벨에 근거식사는 (따라서도 4SU를 붙이기로 함) 티올 특정 biotinylation와 스트렙 타비 딘 - 코팅 자석 구슬을 사용하여 새로 전사 RNA의 엄격한 정화가 따랐다. 그것은 척추 동물, 초파리, 효모 등 미생물의 넓은 범위에 적용 할 수 있습니다. 우리는 성공적으로, 전사 인자의 활동을 실시간으로 속도를 연구 RNA 반감기의 정확한 측정을 제공하며, RNA 처리 속도론에 새로운 통찰력을 얻을 수 4SU - 태그를 적용했다. 마지막으로, 전산 모델링은 기본 분자 메커니즘의 통합, 포괄적 인 분석을 생성하기 위해 사용될 수있다.

서론

유전자 발현 프로파일 링은 세포 프로세스와 관련된 복잡한 상호 작용 네트워크를 연구하는 데 중요한 도구입니다. mRNA의 풍요 로움에 대한 연구는 일반적으로 기본 분자 메커니즘에 대한 기본적인 통찰력을 얻기 위해 선택의 방법이었다. 전체 - 사체 마이크로 어레이 1, RNA (RNA-SEQ) 2-4 최근에는 차세대 시퀀싱의 개발이 방법을 연료. 이 기술은 세포의 유전자 발현의 복잡성에 대한 우리의 이해를 혁명을 가지고 있지만, 그들은 그들의 템플릿 샘플의 고유 특성 즉, 전체 세포 RNA로 인해 큰 한계에 직면하고 있습니다. 총 RNA 수준에서 첫째, 단기 변화는 전사 속도의 변화와 일치하지만, RNA 해당 증명서의 반감기에 근본적으로 의존하지 않는다. 전사 인자에 대한 짧은 증명서, 예를 들어, 인코딩의 다섯 배 유도, 총 RNA에서 쉽게 감지 할 수있을 것입니다 반면시간 내에, 대사 효소 수명이 긴 증명서, 예를 들어, 인코딩 같은 유도가 거의 보이지 않는 상태로 유지됩니다. 또,이 셧다운 (> 1,000 배 아래로 조절) RNA 오시간의 반감기는 평균 유전자의 전사 속도 완료는 단순히 단지 두 가지에 의해 감소​​하기 위해 총 RNA 수준에 대한 다섯 시간 소요됩니다 . 따라서 총 RNA의 분석은 규제 기능 5와 전사 인자와 유전자 인코딩 중 많은 짧은 성적의 최대 규제의 검출을 선호. 또한, 규제의 진정한 운동 폭포가 가려 및 기본 신호 이벤트는 보조 구별 할 수 없습니다. 모두 차례로 하류 생물 정보학 분석에 상당한 편차가 발생할 수 있습니다. 둘째, 총 RNA 수준의 변화는 RNA 합성 또는 붕괴의 변화에​​ 기인 할 수 없습니다. 후자의 측정 transcripti을 차단하는 세포 침입 방법, 예를 들면 필요actinomycin D 6 시간이 지남에 지속적인 RNA 붕괴의 확장 된 모니터링을 사용합니다. 5 포유류 세포에서 평균 mRNA의 반감기 - 10 시간 5,7, 대부분의 유전자의 mRNA 수준은 두 가지 전사 체포 몇 시간에 따라보다 감소 할 것이다. 이 오히려 작은 차이는 기본 수학 방정식의 지수 특성으로 인해 세포의 유전자의 대부분 mRNA의 반감기 심하게 부정확 한 측정의 결과. 마지막으로, 동시에 전체 세포 RNA의 RNA-SEQ는 우리의 유전자의 절반 정도가 대안 접합 이벤트 8, 기본 역학뿐만 아니라 제대로 이해 남아 RNA 가공의 조직 및 상황 별 규제 지침 동적 메커니즘이 적용됩니다 것으로 나타났습니다. 또한, RNA의 기여, 특히 비 코딩 RNAs를 위해 결정되어야 유지, 차등 유전자 발현을 처리. 모두 이러한 제한에 대한 주요 장애물을 나타냅니다기본 분자 메커니즘의 생물 정보학 운동 모델링.

우리는 최근에 이러한 문제에게 5,7,9을 극복하기 위해,라고 고해상도 유전자 발현 프로파일 링 방법을 개발했다. 그것은 4 thiouridine (4SU 태깅), 자연적으로 발생 딘 유도체를 사용하여 새로 전사 RNA의 대사 라벨에 따라 세포 성장과 유전자 발현의 최소한의 간섭 (그림 1 참조) 5를 새로 전사 전사에 직접 액세스를 제공합니다 10-12. 급속한 흡수, 4SU - 인산을 인산화, 그리고 새로 전사 RNA에 결합의 4SU 결과 진핵 세포의 노출. 전체 세포 RN​​A의 분리 후, 4SU - 라벨 RNA 분획은 티올, 특히 비오틴하고 새로 전사 RNA 사이의 이황화 결합을 생성로 만들었다이다. '전체 세포 RN​​A'는 다음 정량 ( '새로 전사')과 레이블 ( '사전 existin 표시로 구분 될 수있다스트렙 타비 딘 - 코팅 자석 구슬을 사용하여 고순도 G ') RNA. 마지막으로, 라벨 RNA는 단순히 이황화 결합을 쪼개서 환원제 (예를 들면 디티 올 트레이 톨)을 추가하고 구슬에서 새로 전사 RNA를 풀어 구슬에서 복구됩니다.

새로 전사 RNA는 4SU 노출의 기간 동안 모든 유전자의 전사 활성을 보여줍니다. 분의 척도에 4SU 태깅 따라서 진핵 생물의 유전자 발현의 스냅 사진과 다운 스트림 생물 정보학 분석 (예 : 프로모터 분석)를위한 이상적인 템플릿을 제공합니다. 정상 상태를 가정 할 수 경우의 비율 새로 전사 / 전체 새로 베껴 / 레이블이와 레이블이없는 / 총 RNA 정확한 RNA 반감기 7,13에 대한 비 침습 액세스를 제공합니다. 또, 4SU - 태깅으로 작은 5로 분 (5 분 4SU-RNA) 후 정제가 새로 전사 RNA를주의하는 것이 중요하다 15, 60 분 4SU-RNA 미만이다.RNA-SEQ와 함께 하나의 실험 설정에서 4SU를 붙이고는 매우 짧고 점차적으로 더 이상 모두를 수행 할 때, RNA 프로세싱의 반응 속도는 염기 해상도 9시에 공개된다. 마지막으로, 전산 모델링과 함께 새로 베껴 총 RNA 시간 코스 분석은 RNA 합성과 부패 14의 통합 분석을 할 수 있습니다.

결론적으로,이 방법은 진핵 세포의 RNA 합성, 처리 및 분해의 역 동성을 직접 분석 할 수 있습니다. 그것은 포유 동물, 곤충 (초파리), 양서류 (Xenopus의), 효모 5,15,16 포함한 모든 주요 모델 생물에 적용됩니다. 그것은 마이크로 어레이 분석 5,17, RNA-SEQ 9,13,14과 직접 호환 및 생체 12,15에 적용됩니다. 여기에, 우리는 세부 방법론, 라벨 분리, 배양 포유 동물 세포에서 새로 전사 RNA를 정화. 또한, 적합한 한쌍에게있는알 문제와 함정을 설명합니다.

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

프로토콜

1. 4 thiouridine과 신진 대사 라벨링

실험 설정 / 일정 세부 계획을 만들어 세포 배양에 4SU를 추가 할 때 샘플을 채취 할 때 예를 들어. 각 조건 사이에 적어도 5 분 계획. 한 번에 하나의 조건의 세포를 처리합니다. 최대 처리 할 수​​ 있습니다. 3 - 주어진 시간에 5 접시. 온도와 CO 2 농도의 변화를 최소화하기 위해 가능한 한 빨리 전지를 처리합니다. 이 세포 단백질 4SU - 라벨 RNA의 가교 될 수 있으므로 4SU가 추가 된 후 밝은 빛에 세포를 노출시키지 마십시오.

라벨의 시작

  1. 해동 4 thiouridine (4SU) 단지 멸균 팔콘 튜브에 각 조건에 대한 4SU의 사용과 피펫 필요한 양 전.
  2. 요리 떨어져 세포 배양 매체의 필요한 금액 (10cm 접시 당 5 ML)를 타고 4SU 함유 팔콘 튜브에 첨가하고 잘 섞는다. 제거하고 요리의 나머지 매체를 폐기하십시오.
    3. <리> 요리에 4SU 함유 배지를 다시 적용합니다.

라벨의 끝

  1. 세포에서 세포 배양액을 제거합니다. 각 플레이트에 TRIZOL의 5 ML을 추가합니다. 여러 시간 지점 또는 조건을 포함 복잡한 실험을 위해,이 단계가 가장 두 사람이 중간 TRIZOL을 추가하고 해물을 수확 기타를 제거 하나에 의해 이루어집니다.
  2. 완전한 세포 용해 실온에서 5 분 알을 품다.
  3. 추가 TRIZOL으로 조심스럽게 접시를 헹굴 10 ㎖ 피펫을 사용합니다. 이 완전한 세포 용해 및 샘플 복구 제품. 피부 나 눈에 접촉 가져올 때 TRIZOL 매우 위험한 상태로 취급주의! 손 페놀 화상 (예를 들면 폴리에틸렌 글리콜 300 또는 산업 메틸화 영혼 (70:30) 400)에 대한 해독제가있다. 폴리 프로필렌 튜브에 샘플을 전송합니다. 표준 팔콘 ​​튜브)이 높은 G의 힘에 저항하지 않도록주의하시기 바랍니다. 샘플은 내가 총 RNA 때까지 적어도 한 달 동안 -20 ° C에 저장할 수 있습니다들 준비.

2. 수정 TRIZOL 프로토콜을 사용하여 RNA 준비

  1. 1 ML 클로로포름 (ML TRIZOL 당 0.2 ML) 추가하고 15 초 동안 격렬하게 흔들어. 3 분 - 2 실온에서 알을 품다.
  2. 4시 15 분 13,000 × g에서 원심 분리기 ° C.
  3. 새로운 15 ML의 폴리 프로필렌 튜브에 수성 상위 단계 (RNA 포함) 전송합니다.
  4. 추가 ½ RNA 침전 버퍼와 이소프로판올 모두의 반응 볼륨 (3 ML 상층에 예를 들어, 1.5 ML RNA 침전 버퍼와 1.5 ML 이소프로판올 추가).
  5. 잘 섞는다. 10 분 실온에서 알을 품다.
  6. 4에서 10 분간 13,000 × g에서 원심 분리기 ° C. 상층 액을 버린다.
  7. 간단히 스핀 다운 (5,000 × g에서 30 초) 200 μL 피펫 잔류 이소프로판올을 제거합니다.
  8. 75 % 에탄올의 동일한 볼륨을 추가하고 펠렛 분리 될 때까지 튜브를 흔들어. residua이 같은 여러 개의 작은 조각으로 파손되지 않도록하는 것은 만들 수 있습니다 제거L의 에탄올 어렵다.
  9. 4에서 10 분간 13,000 × g에서 원심 분리기 ° C. 상층 액을 버린다.
  10. 간단히 RNA를 회전하고 200 μL 피펫으로 남아있는 에탄올을 제거합니다. 20 μL 피펫으로 남아있는 에탄올 단계를 제거를 반복합니다. 이 두 단계 후, 펠렛의 더 건조가 수행되지 않아야합니다.
  11. 100 μg 예상 RNA 수율 당 H 2 O의 100 μl를 추가하고 5를 위아래로 pipetting에 의해 잘 섞는다 - 6 번 RNA를 용해에 도움.
  12. 용해와 65 가열하여 RNA를 변성 ° C 10 분 (뿌리)에 대한 즉시 얼음에 배치합니다.을
  13. 제조업체의 지침에 따라, Nanodrop 분광 광도계를 사용하여 260 nm에서 농도를 RNA 측정합니다. 이 RNA는 적어도 한 달 동안 -80 ° C에 저장할 수 있습니다.

3. 새로 전사 RNA의 싸이 특정 Biotinylation

  1. 60로 시작 - 전체 세포 RN​​A 80 μg합니다.
  2. 반응에 레이블을 구성합니다. 다음의 피펫순서 (당 μg의 RNA)
    1. 1 μL 10X Biotinylation 버퍼
    2. 7 μL RNA (핵산 무료 H 2 O에 희석 1 μg의 RNA를 포함)
    3. 2 μL 비오틴 HPDP (1 MG / ML DMF)

항상 비오틴 HPDP 마지막으로 추가하고 pipetting하여 즉시 섞는다. 비오틴은 침전물 경우에, DMF 콘텐츠는 40 %의 최종 농도를 증가시킬 수있다.

  1. 회전 1.5 시간 동안 실온에서 알을 품다.
  2. 클로로포름의 동일한 볼륨을 추가합니다. 적극적으로 섞는다. 단계 분리하기 시작하고 거품이 사라 시작할 때까지 삼분 - 2 품어.
  3. 4 ℃에서 5 분간 20,000 × g에서 원심 분리 조심스럽게 새로운 튜브로 위 수성 단계를 전송합니다.
  4. 한 단계 3.4 및 3.5를 반복합니다. 당신은 RNA의 손실을 줄이기 위해 2 ㎖ 위상 잠금 젤 무거운 관이 단계를 수행 할 수 있습니다.
  5. RNA 강수량 : 추가 1 / 10 5 M NaCl을의 부피와 같은 부피의물 단계로 이소프로판올.
  6. 4 ℃에서 20 분간 20,000 × g에서 원심 분리 상층 액을 버린다.
  7. 상층 액을 버리고, 4시 10 분 ° C에 대해 20,000 75 % 에탄올, 원심 분리기의 동일한 볼륨 × g을 추가합니다.
  8. 간단히 스핀 200 μL 피펫 잔류 에탄올을 제거합니다.
  9. 간단히 스핀 20 μL 피펫 잔류 에탄올을 제거합니다.
  10. RNA 건조 할 수 없습니다. 50에 다시 일시 중지합니다 - 100 μL H 2 O (1 μg 입력 RNA 당 ~ 1 μL). 6 번 - 5 아래로 피펫에 의해 잘 섞는다.
  11. RNA 저하를 제외 electrophoretical 분석 RNA의 품질을 확인합니다.

4. 4SU​​ - 정관 점 오점 분석 (선택 사항)

4SU​​ 법인은 쉽게 바이오틴 RNA의 점 blot 분석에 의해 결정하실 수 있습니다. 이 문제 해결과 바이오틴 DNA 올리고 컨트롤을 기준으로 4SU 편입 비율의 추정을 허용하는 선택적 단계입니다. 이 분석 우리 연구에 대한단계 3.2 4SU - 라벨 RNA의 biotinylation 대​​신에 바이오틴 HPDP의 iodoacetyl-비오틴 사용 ecommend. 4SU​​-RNA의 돌이킬 수없는 biotinylation이 결과. 따라서 열 기반의 방법 (예 RNeasy) 바이오틴 RNA의 매우 적은 양 (예를 들어, 5 μg)의 복구에 사용할 수 있습니다. RNA는이 분석에 적합합니다 비오틴 - HPDP를 사용하여로 만들었다하지만, 그 결과 신호는 (그림 3) 약한 신호 대 잡음 비율 덜 유리한 것입니다.

  1. 섹션 1과 2에 설명 된대로 전체 세포 RN​​A의 4SU-라벨 및 격리를위한 프로토콜을 따르십시오.
  2. iodoacetyl - 비오틴과 비오틴 - HPDP 교체 3 장에서 설명한 완전히 과도한 iodoacetyl-비오틴 잔류 물을 제거하기 위해 두 클로로포름 추출을 수행 할 때 Biotinylate RNA 4SU - 라벨.
  3. 설명이나 사건 RNA의 소량 (에 (예를 들어, RNeasy) 컬럼 기반 접근 방법을 사용하는 것과 이소 프로필 알코올 / 에탄올 침전 바이오틴 RNA를 복구 <10 μg) 사용됩니다.
  4. 10 분 동안 흔들 nuclease가없는 물 제타 막 품어.
  5. 핵산이없는 물에서 막 가지고 두 개의 깨끗한 종이 타월 단단히 눌러 중간에 막 배치하여 과도한 액체를 제거합니다. 공기 건조 5 분 막하는 것이 더 좋은 점 발생합니다.
  6. 각 샘플은 차가운 얼음 점 오점 바인딩 버퍼 (10 MM NaOH를 1 mM의 EDTA)를 사용하여 200 μL / NG RNA의 20 μl를 준비합니다. pipetting하여 제타 막이 희석의 5 μL (RNA 즉 1 μg)뿐만 아니라 세 이후에 10 배 희석 (각각 즉, 100, 10, 1 NG RNA를) 적용 할 수 있습니다. 피펫 팁의 빈 선반을 피펫은 고르게 분포 간격을 제공하기 위해 사용될 수있다. 또한, 제조업체의 지침에 따라 점 오점 장치를 사용합니다.
  7. 긍정적 연속으로 20 일부터 μL / NG 20 PG / μL (즉, 100-0.1 NG 올리고)에 이르기까지 농도에서 비오틴 - 라벨 DNA 올리고의 5 μl를 적용pipetting하여 막 ROL. 대조군으로 바이오틴, 4SU - 순진 샘플을 사용합니다.
  8. 공기 건조 5 분 막.
  9. 락 40 ML 차단 버퍼에 30 분 동안 막 품어.
  10. 15 분 (5 ML PBS가 + 5 ML 20 % SDS + 10 ㎕의 스트렙 타비 딘 - 고추 냉이 과산화 효소)에 대한 1:1,000 스트렙 타비 딘 - 고추 냉이 퍼 옥시 데이즈 10 mL로 막을 배양
  11. 5 분 40 ML PBS + 10 % SDS (20 ML PBS가 + 20ml를 20 % SDS)에 두 번 막 씻으십시오.
  12. 40 ML PBS로 두 번 막 씻어 5 분 + 1 % SDS (38 ML PBS가 + 2 ML 20 % SDS).
  13. 40 ML PBS로 두 번 막 씻어 5 분 + 0.1 % SDS (40 ML PBS가 + 200 ㎕의 20 % SDS).
  14. 두 깨끗한 종이 타월 사이에 막 배치하고 단단히 그들을 눌러 과도한 액체를 제거합니다.
  15. 제조업체의 지침에 따라 ECL을 사용하는 멤브레인 바인딩 HRP을 시각화.
  16. 플라스틱 호일 / 가방에 막 배치, 공기 방울을 제거하고 어둠 속에서 2 분 동안 품어.
  17. 막에 노출1 막 - 5 분​​.

5. 스트렙 타비 딘 - 코팅 자석 구슬을 사용하여 레이블과 레이블없는 RNA의 분리

  1. 열 ° C의 물을 욕조에 65 (샘플 당 3 mL)에 버퍼를 세척.
  2. nuclease가없는 H 2 O에 신선한 100 MM의 디티 올 트레이 톨 (DTT)를 준비 초 미세 규모에 배치 깨끗한 50 ML 팔콘 튜브에 DTT 분말의 30 MG - 15 경사 분리하여이를 수행. nuclease가없는 H 2 O의 필요한 양을 달아 추가
  3. 열 ° C 10 변성하는 분, 얼음에 즉시 장소를 65 RNA 샘플로 만들었다.
  4. 장소는 마그네틱 스탠드에 열을 μMacs. 우리는 한 번에 12 개 이상의 샘플 (- 8 샘플이 최적이다 6) 처리를하지 않는 것이 좋습니다.
  5. 1 ML 실온 버퍼를 세척으로 미리 평형 소개 Miltenyi 열. 이 약 15 분 소요됩니다.
  6. 한편, 50 스트렙 타비 딘 구슬 100 μL를 추가합니다 - 바이오틴 RNA의 100 μl를. 회전 15 분 실온에서 알을 품다.
    7. < 리> 열 중 하나가 지금까지 배출 시작되지 않은 경우이를 부드럽게 장갑을 낀 손가락으로 열 상단을 눌러 의해 촉진 될 수있다. 일단 흐름은 열이 쉽게 배출하기 시작했다.
  7. 열에 RNA / 비즈를 적용합니다. 흐름을 통해 당신은 레이블이없는 RNA 분획 (7 항 참조)를 복구하려는 경우가 아니면 폐기하십시오.
  8. 0.9 65 ML ° C 세척 버퍼 (65 ° C에서 버퍼를 피펫 팅 할 때 1 ML 피펫 팁 축소).로 3 회 세척
  9. 0.9 ML 실온 버퍼 세탁 3 회 씻는다.
  10. 피펫 700 μL 버퍼 새로운 2 ㎖ 튜브에 RLT (RNeasy MinElute 정리 키트 퀴 아젠)와 열 아래에 배치합니다.
  11. 열을 100 MM의 DTT의 100 μl를 추가하여 RLT 버퍼에 새로 전사 RNA를 용출.
  12. 100 MM의 DTT의 또 다른 100 μl를 추가하여 나중에 동일한 튜브에 두 번째 용출 라운드 3 분을 수행합니다.

6. 새로 전사 RNA 복구

ontent는 "> 제조 업체의 지침에 따라 RNeasy MinElute 정리 (Qiagen의) 프로토콜을 계속 진행합니다. 25 μL nuclease가없는 H 2 O 측정 RNA 농도에서 용출이 Nanodrop 분광 광도계를 사용하여. 제출하기 전에 RNA를 해동하고 다시 동결하지 않으려면 그것은 높은 처리량 분석에, 우리는 즉시 새로 전사 RNA 후 cDNA를 준비하는 것이 좋습니다이 정화됩니다. 제조업체의 지침에 따라 cDNA를 합성 20 μL의 cDNA 합성 믹스 새로 전사 RNA의 2.5 μl를 사용합니다. 1을 사용 QRT-PCR 컨트롤을 수행 : cDNA를 혼합 10 희석 -80에서 보관 RNA ° C..

7. 레이블이없는, 언 바운드 RNA (선택 사항) 복구

경우에 언 바운드 RNA 복구 할 필요가; 흐름을 통해 (열을 RNA-스트렙 타비 딘 비즈 솔루션을 추가 한 후) 이후의 강수량에 대한 첫 번째 세척을 수집하고 결합한다. 보통 생로 언 바운드 RNA의 50 %가 침전 충분하다s는 출발 물질의> 80 %를 포함합니다.

  1. 이소프로판올의 동일한 볼륨을 추가 (아무런 소금 세척 버퍼가 이미 1 M의 NaCl을 포함으로 추가 할 필요가 없습니다).
  2. 4 ℃에서 20 분간 20,000 × g에서 원심 분리 상층 액을 버린다.
  3. 상층 액을 버리고, 4시 10 분 ° C에 대해 20,000 75 % 에탄올, 원심 분리기의 동일한 볼륨 × g을 추가합니다.
  4. 간단히 스핀 200 μL 피펫 잔류 에탄올을 제거합니다.
  5. 간단히 스핀 20 μL 피펫 잔류 에탄올을 제거합니다.
  6. RNA 건조 할 수 없습니다. 100 μL H 2 O에 resuspend을 6 번 - 5 아래로 피펫에 의해 잘 섞는다. 동요와 함께 10 분 동안 65 ° C에서 알을 품다과 얼음에 직접 전송할 수 있습니다.
  7. RNA 저하를 제외 electrophoretical 분석 RNA의 품질을 확인합니다.

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

결과

1. 원료 및 예상 수익률

4SU​​ 노출 1 시간 (시간)에 따라 새로 전사 RNA는 약 1 대표 - 전체 세포 RN​​A의 4 %를. 그들은 더 이상 세포 성장 / 복제 계정에 RNA를 합성하지 않기 때문에이 성장 체포 세포에서 낮은 것입니다. 총 RNA의 80 μg - 1 시간 동안 붙일 경우, 우리는 60와 분석을 시작하는 것이 좋습니다. biotinylation 단계 이후 확인하기 어려운 작은 RNA 펠렛 총 RNA 결과보다 30 μg으로 시작하기 때문에 쉽게 손실 될 수 있습니다. 입력 RNA 수준은 라벨의 매우 짧은 기간 (- 10 분 예를 들면 5)를위한 많은 150으로 μg 증가 될 수 있습니다. RNA 라벨의 지속 시간은 1 시간에 5 ​​분 ~ 60 %에서 ~ 80 % 9 새로 전사 RNA 증가의 짧은 인트론 서열의 기여에서 단축됩니다. 인트론은 상당히 긴 시퀀스를 코딩뿐만 아니라, 5'-및 3'-UTRs 비교되...

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

토론

새로 전사 RNA 대사 라벨이 실질적으로 관심의 생물학적 문제를 해결하기 위해 더 적합한 템플릿을 제공하여 마이크로 어레이 및 RNA-SEQ와 같은 높은 처리량 기술의 힘을 강화한다. 본 프로토콜은 광범위한 최적화를 받았다. 그것은 새로 전사 RNA의> 1,000 배 농축을 허용하고 재현성이 높은 결과를 제공합니다.

새로 전사 RNA는 4SU에 세포의 노출 시간 동안 실시간으로 전사 활동을 묘사하므로 4SU 태깅 실험의 실험 설계는 매우 중요합니다. 자극에 따라 전사 요금의 실제 변화는 이미 가라 경우 총 RNA 수치의 변화는 여전히 감지 할 수 있더라도 새로 전사 RNA를 분석 할 때, 이러한 누락됩니다. 따라서, 기본 생물학의 좋은 이해는 실험 장치뿐 아니라 최적의 기간 (을)를 정의하는 것이 중요합니다4SU​​ 노출 F 시간. 아래, 우리는 추천과 가장 중요한 단계는 일반적인 함정을 피할 수있는 방법을 제공합니다.

주식...

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

공개 사항

저자는 그들이 더 경쟁 재정적 이익이 없다는 것을 선언합니다.

감사의 글

우리는 원고의주의 읽기 에이미 레이건에게 감사의 말씀을 전합니다. 이 작품은 LD와 CCF에 DFG 부여 FR2938/1-1에 NGFN 플러스 부여 # 01GS0801, MRC 교제를 부여 G1002523 및 NHSBT 부여 WP11-05에 의해 지원되었다

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
4-thiouridineCarbosynthT4509메마른 H2O에 있는 50 mM 주식을 준비하고, -20 °에 저장한다; 50-500 &mu의 부분 표본 중 C; l, 사용하지 않은 시약을 버리고 다시 얼리지 마십시오.
TrizolInvitrogen15596026 (100 ml), 15596018 (200 ml)경고 - 부식성 및 건강에 해롭습니다! 페놀 해독제 (PEG-메탄올)에 대한 즉각적인 접근을 보장합니다; 4 °C에 보관하십시오.
클로로포름시그마372978WARNING - 건강에 유해
이소프로판올시그마650447
구연산나트륨, 뉴클레아제 무함유SigmaC8532뉴클레아제가 없는 물을 사용하여 1.6M 원액을 준비합니다.
5M 뉴클레아제가 없는 NaClSigma71386원액
뉴클레아제가 없는 H2OSigmaW4502뉴클레아제가 없는 튜브에서 1ml의 분취액을 만듭니다.
RNA 침전 완충액1.2 M NaCl, 뉴클레아제가 없는 물에 0.8 M 구연산나트륨. 엄격하게 뉴클레아제가 없는 조건에서 미리 준비하십시오. 50ml 팔콘 튜브에 넣어 실온에서 보관하십시오.
에탄올시그마459844뉴클레아제가 없는 물과 함께 사용하여 80% 에탄올을 준비하고 -20°C에서 보관합니다.
1 M 뉴클레 아제가없는 Tris Cl, pH 7.5Lonza51237원액
500 mM 뉴클레아제가없는 EDTA, pH 8.0Invitrogen15575-020원액
10x 비오틴화 완충액 (BB)100 mM 트리스 pH 7.4, 10 mM EDTA 뉴클레아제가없는 물에서 1ml의 분취액을 만듭니다.
디메틸포름아미드(DMF)SigmaD4551
EZ-Link 비오틴-HPDPPierce2134150mg 비오틴-HPDP를 50ml DMF에 용해하여 1mg/ml 원액을 준비합니다. 부드러운 온난화는 용해를 향상시킵니다. 4 °에 저장; C는 1ml의 분취액에 있습니다.
Phase Lock Gel Heavy tubes 2.0 mlEppendorf0032 005.152클로로포름 추출 단계 옵션.
Zeta membraneBIORAD162-0153
10x Dot blot binding buffer100 mM NaOH, 10 mM EDTA
Biotin-oligo5'-biotin, 25 nucleotides, any
sequence 도데실황산나트륨FisherBPE9738100 ml 20% 원액의 경우 80 ml PBS pH 7-8에 20 g SDS를 첨가하고 부피를 100 ml로 조절합니다. 20 °C 이상의 모든 고함량 SDS 용액을 유지하십시오. 따뜻함 SDS가 약간 침전되어야 합니다.
EZ-Link Iodoacetyl-LC-BiotinPierce2133350mg 요오도아세틸-비오틴을 50ml DMF에 용해하여 1mg/ml 원액을 준비합니다. 부드러운 온난화는 용해를 향상시킵니다. 4 °에 저장; C는 1ml의 분취액에 있습니다. 비가역적인 티올 특이적 비오틴화(biotinylation)를 생성합니다.
인산염 완충액 식염수Gibco10010-015
도트 블롯 차단 완충액20ml 20% SDS와 20ml 1 x PBS pH 7-8을 혼합하고 최종 농도 1mM에 EDTA를 첨가합니다.
Streptavidin-horseradish peroxidase Vector LaboratoriesSA5004-20 °C. 10 ml 1 x PBS와 10 ml 20% SDS를 혼합합니다. 20 추가 μ l 사용 전 Streptavidin-HRP.
ECL 시약GE HealthcareRNP2109제조업체의 지침에 따라 사용하십시오.
Super RX, X-RA 필름, 18x24 cm후지필름47410 19236
μ Macs Streptavidin KitMiltenyi130-074-1014 °C에 구슬을 보관하십시오.
트윈 20시그마P1379
세척 버퍼100mM 트리스 pH 7.4, 10mM EDTA, 1M NaCl, 0.1% 뉴클레아제가 없는 H2O의 트윈 20.
디티오트레이톨 (DTT)Sigma43817뉴클레아제가 없는 H2O에서 100 mM DTT로 준비하고, 사용하기 전에 항상 신선하게 준비하십시오.
RNeasy MinElute KitQiagen742044°C에 열 저장; C, 실온에서 키트의 나머지 구성 요소.
1.5ml 스크류탑 폴리프로필렌 튜브Sarstedt72.692.005Dimethylformamide
2.0ml 스크류탑 폴리프로필렌 튜브Sarstedt72.694.005Dimethylformamide
15ml 튜브Falcon352096Dimethylformamide
50ml 튜브Falcon352070Dimethylformamide와 호환
달리 명시되지 않는 한 모든 용액/시약은 실온에서 보관해야 합니다.
Equipment
UV/VIS 분광 광도계Thermo ScientificNanoDrop 1000또는 동급. 낮은 볼륨(1-2 μ l) 과도한 샘플 손실을 방지하기 위해 낮은 RNA 농도를 측정합니다.
폴리프로필렌 15 ml 원심분리기 튜브VWR International525-0153표준 15 ml 튜브와 대조적으로, 이들은 최대 15,000 ×를 견딜 수 있습니다;
g 고속 원심분리기Beckman CoulterAvanti J-25또는 13,000×에 도달할 수 있는 동등한 장비; g
고속 로터Beckman CoulterJLA-16250또는 13,000×에 도달할 수 있는 동등한 장비; g
15 ml 튜브용 어댑터Laborgerä te Beranek356964또는 13,000×에 도달할 수 있는 동등한 장비; g
냉장 탁상형 원심분리기Eppendorf5430 R또는 동급.
ThermomixerEppendorfThermomixer compactOr 동급.
자기 스탠드Miltenyi Biotec130-042-109한 스탠드는 8 &mu를 보유; Macs 열.
WaterbathGrantSUB Aqua 5또는 동급.
초미세 스케일A& DGR-202또는 동급.
E-Gel iBase Power SystemInvitrogenG6400UKRNA 겔용; 또는 이와 동등한.
E-Gel EX 1% 아가로스 프리캐스트 겔InvitrogenG4020-01RNA 겔용; 또는 이와 동등한.
는 와 호환 와 호환 BD 와 호환 BD 가능

참고문헌

  1. Brown, P. O., Botstein, D. Exploring the new world of the genome with DNA microarrays. Nature Genetics. 21, 33-37 (1999).
  2. Mortazavi, A., Williams, B. A., Mccue, K., Schaeffer, L., Wold, B. Mapping and quantifying mammalian transcriptomes by RNA-Seq. Nature Methods. 5, 621-628 (2008).
  3. Nagalakshmi, U., Wang, Z., et al. The transcriptional landscape of the yeast genome defined by RNA sequencing. Science. 320, 1344-1349 (2008).
  4. Wilhelm, B. T., Marguerat, S., et al. Dynamic repertoire of a eukaryotic transcriptome surveyed at single-nucleotide resolution. Nature. 453, 1239-U1239 (2008).
  5. Dölken, L., Ruzsics, Z., et al. High-resolution gene expression profiling for simultaneous kinetic parameter analysis of RNA synthesis and decay. RNA. 14, 1959-1972 (2008).
  6. Yang, E., van Nimwegen, E., et al. Decay rates of human mRNAs: correlation with functional characteristics and sequence attributes. Genome Res. 13, 1863-1872 (2003).
  7. Friedel, C. C., Dölken, L., Ruzsics, Z., Koszinowski, U. H., Zimmer, R. Conserved principles of mammalian transcriptional regulation revealed by RNA half-life. Nucleic Acids Res. 37, e115(2009).
  8. Nilsen, T. W., Graveley, B. R. Expansion of the eukaryotic proteome by alternative splicing. Nature. 463, 457-463 (2010).
  9. Windhager, L., Bonfert, T., et al. Ultra short and progressive 4sU-tagging reveals key characteristics of RNA processing at nucleotide resolution. Genome Res. , (2012).
  10. Melvin, W. T., Milne, H. B., Slater, A. A., Allen, H. J., Keir, H. M. Incorporation of 6-thioguanosine and 4-thiouridine into RNA. Application to isolation of newly synthesised RNA by affinity chromatography. Eur. J Biochem. 92, 373-379 (1978).
  11. Cleary, M. D., Meiering, C. D., Jan, E., Guymon, R., Boothroyd, J. C. Biosynthetic labeling of RNA with uracil phosphoribosyltransferase allows cell-specific microarray analysis of mRNA synthesis and decay. Nature Biotechnology. 23, 232-237 (2005).
  12. Kenzelmann, M., Maertens, S., et al. Microarray analysis of newly synthesized RNA in cells and animals. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 6164-6169 (2007).
  13. Schwanhäusser, B., Busse, D., et al. Global quantification of mammalian gene expression control. Nature. 473, 337-342 (2011).
  14. Rabani, M., Levin, J. Z., et al. Metabolic labeling of RNA uncovers principles of RNA production and degradation dynamics in mammalian cells. Nat. Biotechnol. , (2011).
  15. Miller, M. R., Robinson, K. J., Cleary, M. D., Doe, C. Q. TU-tagging: cell type-specific RNA isolation from intact complex tissues. Nat. Methods. 6, 439-441 (2009).
  16. Miller, C., Schwalb, B., et al. Dynamic transcriptome analysis measures rates of mRNA synthesis and decay in yeast. Mol. Syst. Biol. 7, 458(2011).
  17. Weintz, G., Olsen, J. V., et al. The phosphoproteome of toll-like receptor-activated macrophages. Mol. Syst. Biol. 6, 371(2010).
  18. Lipsett, M. N. The isolation of 4-thiouridylic acid from the soluble ribonucleic acid of Escherichia coli. Journal of Biological Chemistry. 240, 3975-3978 (1965).
  19. Marcinowski, L., Liedschreiber, M., et al. Real-time Transcriptional Profiling of Cellular and Viral Gene Expression during Lytic Cytomegalovirus Infection. PLoS Pathog. 8, e1002908(2012).
  20. Chomczynski, P., Mackey, K. Short technical reports. Modification of the TRI reagent procedure for isolation of RNA from polysaccharide- and proteoglycan-rich sources. Biotechniques. 19, 942-945 (1995).
  21. Friedel, C. C., Dölken, L. Metabolic tagging and purification of nascent RNA: implications for transcriptomics. Mol. Biosyst. 5, 1271-1278 (2009).
  22. Friedel, C. C., Kaufmann, S., Dölken, L., Zimmer, R. HALO - A Java framework for precise transcript half-life determination. Bioinformatics. , (2010).

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

재인쇄 및 허가

태그

RNA 가공RNA 분해4-티오우리딘 표지티올 특이적 비오틴화스트렙타비딘 자기 비드신규 전사 RNA 정제Q-RT-PCR 분석차세대 염기서열 분석
세포 배양에서 RNA 합성, 처리 및 부패의 높은 해상도 유전자 발현 프로파일에 대한 새로 전사 RNA 대사 라벨링
문의하기
도서관에 추천하기

개인정보 처리방침

이용 약관

정책

저작권 © 2026 MyJoVE Corporation. 모든 권리 보유.