세포 배양에서 RNA 합성, 처리 및 부패의 높은 해상도 유전자 발현 프로파일에 대한 새로 전사 RNA 대사 라벨링

요약

전체 세포 RN​​A 단기 RNA 합성과 붕괴의 변화뿐만 아니라 RNA 처리 속도론을 연구 가난한 템플릿을 제공합니다. 여기에, 우리는 4 thiouridine에 새로 전사 RNA의 대사 라벨을 설명하는 이러한 한계를 극복 할 수 있도록 새로 전사 RNA의 싸이 특정 biotinylation 및 정제에 의해 따랐다.

초록

전체 - 사체 마이크로 어레이 차세대 시퀀싱의 개발은 세포의 유전자 발현의 복잡성에 대한 우리의 이해를 혁명하고 있습니다. 참여 분자 메커니즘에 대한 이해와 함께, 기본 역학의 정확한 측정은 점점 중요 해지고있다. 여기에 이러한 강력한 방법론 템플릿 샘플들이 연구 즉, 전체 세포 RNA의 고유 특성으로 인해 주요 한계에 직면하고 있습니다. 대부분의 경우 전체 세포 RN​​A의 변화는 충분한 해상도를 기본 분자 사건과 반응 속도를 나타내는 하나 너무 느리게 혹은 너무 빨리 발생합니다. 또한, RNA 합성, 처리 및 부패의 변화의 기여도는 쉽게 구별되지 않습니다.

우리는 최근 이러한 한계를 극복하기 위해 고해상도 유전자 발현 프로파일을 개발했습니다. 우리의 접근 방식은 4 thiouri에 새로 전사 RNA의 대사 라벨에 근거식사는 (따라서도 4SU를 붙이기로 함) 티올 특정 biotinylation와 스트렙 타비 딘 - 코팅 자석 구슬을 사용하여 새로 전사 RNA의 엄격한 정화가 따랐다. 그것은 척추 동물, 초파리, 효모 등 미생물의 넓은 범위에 적용 할 수 있습니다. 우리는 성공적으로, 전사 인자의 활동을 실시간으로 속도를 연구 RNA 반감기의 정확한 측정을 제공하며, RNA 처리 속도론에 새로운 통찰력을 얻을 수 4SU - 태그를 적용했다. 마지막으로, 전산 모델링은 기본 분자 메커니즘의 통합, 포괄적 인 분석을 생성하기 위해 사용될 수있다.

서론

유전자 발현 프로파일 링은 세포 프로세스와 관련된 복잡한 상호 작용 네트워크를 연구하는 데 중요한 도구입니다. mRNA의 풍요 로움에 대한 연구는 일반적으로 기본 분자 메커니즘에 대한 기본적인 통찰력을 얻기 위해 선택의 방법이었다. 전체 - 사체 마이크로 어레이 ^1, RNA (RNA-SEQ) ^2-4 최근에는 차세대 시퀀싱의 개발이 방법을 연료. 이 기술은 세포의 유전자 발현의 복잡성에 대한 우리의 이해를 혁명을 가지고 있지만, 그들은 그들의 템플릿 샘플의 고유 특성 즉, 전체 세포 RNA로 인해 큰 한계에 직면하고 있습니다. 총 RNA 수준에서 첫째, 단기 변화는 전사 속도의 변화와 일치하지만, RNA 해당 증명서의 반감기에 근본적으로 의존하지 않는다. 전사 인자에 대한 짧은 증명서, 예를 들어, 인코딩의 다섯 배 유도, 총 RNA에서 쉽게 감지 할 수있을 것입니다 반면시간 내에, 대사 효소 수명이 긴 증명서, 예를 들어, 인코딩 같은 유도가 거의 보이지 않는 상태로 유지됩니다. 또,이 셧다운 (> 1,000 배 아래로 조절) RNA 오시간의 반감기는 평균 유전자의 전사 속도 완료는 단순히 단지 두 가지에 의해 감소​​하기 위해 총 RNA 수준에 대한 다섯 시간 소요됩니다 . 따라서 총 RNA의 분석은 ....

프로토콜

1. 4 thiouridine과 신진 대사 라벨링

실험 설정 / 일정 세부 계획을 만들어 세포 배양에 4SU를 추가 할 때 샘플을 채취 할 때 예를 들어. 각 조건 사이에 적어도 5 분 계획. 한 번에 하나의 조건의 세포를 처리합니다. 최대 처리 할 수​​ 있습니다. 3 - 주어진 시간에 5 접시. 온도와 CO ₂ 농도의 변화를 최소화하기 위해 가능한 한 빨리 전지를 처리합니다. 이 세포 단백질 4SU - 라벨 RNA의 가교 될 수 있으므로 4SU가 추가 된 후 밝은 빛에 세포를 노출시키지 마십시오.

라벨의 시작

1. 해동 4 thiouridine (4SU) 단지 멸균 팔콘 튜브에 각 조건에 대한 4SU의 사용과 피펫 필요한 양 전.
2. 요리 떨어져 세포 배양 매체의 필요한 금액 (10cm 접시 당 5 ML)를 타고 4SU 함유 팔콘 튜브에 첨가하고 잘 섞는다. 제거하고 요리의 나머지 매체를 폐기하십시오.
<리> 요리에 4SU 함유 배지를 다시 적용합니다.

라벨의 끝

4. 세포에서 세포 배양액을 제거합니다. 각 플레이트에 TRI....

결과

1. 원료 및 예상 수익률

4SU​​ 노출 1 시간 (시간)에 따라 새로 전사 RNA는 약 1 대표 - 전체 세포 RN​​A의 4 %를. 그들은 더 이상 세포 성장 / 복제 계정에 RNA를 합성하지 않기 때문에이 성장 체포 세포에서 낮은 것입니다. 총 RNA의 80 μg - 1 시간 동안 붙일 경우, 우리는 60와 분석을 시작하는 것이 좋습니다. biotinylation 단계 이후 확인하기 어려운 작은 RNA 펠렛 총 RNA 결과보다 30 μg으로 시작하기 때문에 쉽게 손실 될 수 있습니다. 입력 RNA 수준은 라벨의 매우 짧은 기간 (- 10 분 예를 들면 5)를위한 많은 150으로 μg 증가 될 수 있습니다. RNA 라벨의 지속 시간은 1 시간에 5 ​​분 ~ 60 %에서 ~ 80 % ⁹ 새로 전사 RNA 증가의 짧은 인트론 서열의 기여에서 단축됩니다. 인트론은 상당히 긴 시퀀스를 코딩뿐만 아니라, 5'-및 3'-UTRs 비교되.......

토론

새로 전사 RNA 대사 라벨이 실질적으로 관심의 생물학적 문제를 해결하기 위해 더 적합한 템플릿을 제공하여 마이크로 어레이 및 RNA-SEQ와 같은 높은 처리량 기술의 힘을 강화한다. 본 프로토콜은 광범위한 최적화를 받았다. 그것은 새로 전사 RNA의> 1,000 배 농축을 허용하고 재현성이 높은 결과를 제공합니다.

새로 전사 RNA는 4SU에 세포의 노출 시간 동안 실시간으로 전사 활동을 묘사하므로 4SU 태깅 실험의 실험 설계는 매우 중요합니다. 자극에 따라 전사 요금의 실제 변화는 이미 가라 경우 총 RNA 수치의 변화는 여전히 감지 할 수 있더라도 새로 전사 RNA를 분석 할 때, 이러한 누락됩니다. 따라서, 기본 생물학의 좋은 이해는 실험 장치뿐 아니라 최적의 기간 (을)를 정의하는 것이 중요합니다4SU​​ 노출 F 시간. 아래, 우리는 추천과 가장 중요한 단계는 일반적인 함정을 피할 수있는 방법을 제공합니다.

주식.......

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
4-thiouridine	Carbosynth	T4509	메마른 H2O에 있는 50 mM 주식을 준비하고, -20 °에 저장한다; 50-500 &mu의 부분 표본 중 C; l, 사용하지 않은 시약을 버리고 다시 얼리지 마십시오.
Trizol	Invitrogen	15596026 (100 ml), 15596018 (200 ml)	경고 - 부식성 및 건강에 해롭습니다! 페놀 해독제 (PEG-메탄올)에 대한 즉각적인 접근을 보장합니다; 4 °C에 보관하십시오.
클로로포름	시그마	372978	WARNING - 건강에 유해
이소프로판올	시그마	650447
구연산나트륨, 뉴클레아제 무함유	Sigma	C8532	뉴클레아제가 없는 물을 사용하여 1.6M 원액을 준비합니다.
5M 뉴클레아제가 없는 NaCl	Sigma	71386	원액
뉴클레아제가 없는 H2O	Sigma	W4502	뉴클레아제가 없는 튜브에서 1ml의 분취액을 만듭니다.
RNA 침전 완충액			1.2 M NaCl, 뉴클레아제가 없는 물에 0.8 M 구연산나트륨. 엄격하게 뉴클레아제가 없는 조건에서 미리 준비하십시오. 50ml 팔콘 튜브에 넣어 실온에서 보관하십시오.
에탄올	시그마	459844	뉴클레아제가 없는 물과 함께 사용하여 80% 에탄올을 준비하고 -20°C에서 보관합니다.
1 M 뉴클레 아제가없는 Tris Cl, pH 7.5	Lonza	51237	원액
500 mM 뉴클레아제가없는 EDTA, pH 8.0	Invitrogen	15575-020	원액
10x 비오틴화 완충액 (BB)			100 mM 트리스 pH 7.4, 10 mM EDTA 뉴클레아제가없는 물에서 1ml의 분취액을 만듭니다.
디메틸포름아미드(DMF)	Sigma	D4551
EZ-Link 비오틴-HPDP	Pierce	21341	50mg 비오틴-HPDP를 50ml DMF에 용해하여 1mg/ml 원액을 준비합니다. 부드러운 온난화는 용해를 향상시킵니다. 4 °에 저장; C는 1ml의 분취액에 있습니다.
Phase Lock Gel Heavy tubes 2.0 ml	Eppendorf	0032 005.152	클로로포름 추출 단계 옵션.
Zeta membrane	BIORAD	162-0153
10x Dot blot binding buffer			100 mM NaOH, 10 mM EDTA
Biotin-oligo			5'-biotin, 25 nucleotides, any
sequence 도데실황산나트륨	Fisher	BPE9738	100 ml 20% 원액의 경우 80 ml PBS pH 7-8에 20 g SDS를 첨가하고 부피를 100 ml로 조절합니다. 20 °C 이상의 모든 고함량 SDS 용액을 유지하십시오. 따뜻함 SDS가 약간 침전되어야 합니다.
EZ-Link Iodoacetyl-LC-Biotin	Pierce	21333	50mg 요오도아세틸-비오틴을 50ml DMF에 용해하여 1mg/ml 원액을 준비합니다. 부드러운 온난화는 용해를 향상시킵니다. 4 °에 저장; C는 1ml의 분취액에 있습니다. 비가역적인 티올 특이적 비오틴화(biotinylation)를 생성합니다.
인산염 완충액 식염수	Gibco	10010-015
도트 블롯 차단 완충액			20ml 20% SDS와 20ml 1 x PBS pH 7-8을 혼합하고 최종 농도 1mM에 EDTA를 첨가합니다.
Streptavidin-horseradish peroxidase	Vector Laboratories	SA5004	-20 °C. 10 ml 1 x PBS와 10 ml 20% SDS를 혼합합니다. 20 추가 μ l 사용 전 Streptavidin-HRP.
ECL 시약	GE Healthcare	RNP2109	제조업체의 지침에 따라 사용하십시오.
Super RX, X-RA 필름, 18x24 cm	후지필름	47410 19236
μ Macs Streptavidin Kit	Miltenyi	130-074-101	4 °C에 구슬을 보관하십시오.
트윈 20	시그마	P1379
세척 버퍼			100mM 트리스 pH 7.4, 10mM EDTA, 1M NaCl, 0.1% 뉴클레아제가 없는 H2O의 트윈 20.
디티오트레이톨 (DTT)	Sigma	43817	뉴클레아제가 없는 H2O에서 100 mM DTT로 준비하고, 사용하기 전에 항상 신선하게 준비하십시오.
RNeasy MinElute Kit	Qiagen	74204	4°C에 열 저장; C, 실온에서 키트의 나머지 구성 요소.
1.5ml 스크류탑 폴리프로필렌 튜브	Sarstedt	72.692.005	Dimethylformamide
2.0ml 스크류탑 폴리프로필렌 튜브	Sarstedt	72.694.005	Dimethylformamide
15ml 튜브	Falcon	352096	Dimethylformamide
50ml 튜브	Falcon	352070	Dimethylformamide와 호환
달리 명시되지 않는 한 모든 용액/시약은 실온에서 보관해야 합니다.
Equipment
UV/VIS 분광 광도계	Thermo Scientific	NanoDrop 1000	또는 동급. 낮은 볼륨(1-2 μ l) 과도한 샘플 손실을 방지하기 위해 낮은 RNA 농도를 측정합니다.
폴리프로필렌 15 ml 원심분리기 튜브	VWR International	525-0153	표준 15 ml 튜브와 대조적으로, 이들은 최대 15,000 ×를 견딜 수 있습니다;
g 고속 원심분리기	Beckman Coulter	Avanti J-25	또는 13,000×에 도달할 수 있는 동등한 장비; g
고속 로터	Beckman Coulter	JLA-16250	또는 13,000×에 도달할 수 있는 동등한 장비; g
15 ml 튜브용 어댑터	Laborgerä te Beranek	356964	또는 13,000×에 도달할 수 있는 동등한 장비; g
냉장 탁상형 원심분리기	Eppendorf	5430 R	또는 동급.
Thermomixer	Eppendorf	Thermomixer compact	Or 동급.
자기 스탠드	Miltenyi Biotec	130-042-109	한 스탠드는 8 &mu를 보유; Macs 열.
Waterbath	Grant	SUB Aqua 5	또는 동급.
초미세 스케일	A& D	GR-202	또는 동급.
E-Gel iBase Power System	Invitrogen	G6400UK	RNA 겔용; 또는 이와 동등한.
E-Gel EX 1% 아가로스 프리캐스트 겔	Invitrogen	G4020-01	RNA 겔용; 또는 이와 동등한.

는 와 호환 와 호환 BD 와 호환 BD 가능