시간 경과 영상은 특정 행동 매개 변수 독특한 유전 적 병변 사이에 상관 관계가 있는지 확인하기 위해 유방암 위험 유전자 변형 마우스 모델에서 파생 된 기본 preneoplastic 유방 상피 세포의 행동을 평가하는 데 사용됩니다.
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방법 논문
기본 Preneoplastic 유방 상피 세포의 시간 경과 영상은 유방암의 유전자 변형 마우스 모델에서 파생
이 논문에서
요약
초록
시간 경과 영상은 유방암의 여러 유전자 변형 마우스 모델에서 파생 된 배양 주요 preneoplastic 유방 상피 세포의 행동을 비교하는 데 사용할 수 있습니다. 예를 들어, 세포 분열 (세포 수명), apoptotic 세포 번호, 형태학의 변화의 진화, 그리고 식민지 형성의 메커니즘 사이의 시간은 정량 할 수 있으며, 특정 유전 병변을 가진 세포에 비교했다. 기본 유방 상피 세포 문화가 만져서 알 수있는 종양이없는 유방 땀샘에서 생성됩니다. 분비는 신중하게 인접 근육의 명확한 분리와 resected 있으며, 림프절이 제거되며, 풍부한 유방 상피 세포의 단일 셀 중지는 효소 분해 및 여과 뒤에 날카 유방 조직에 의해 생성됩니다. 단일 셀 중지는 라이브 세포 이미징을위한 보육 챔버 내에서 도금과 현미경 바로 아래에 배치됩니다. 각 w에서 4x4 구성에서 열 여섯 650 μm X 700 μm 분야6 잘 접시의 엘자은 5 일 동안 매 15 분 이미징 있습니다. 시간 경과 이미지는 직접 처음 24 세포를 도금 시간 (집계 대 세포 증식), apoptosis의 입사 및 형태학의 변경 사항을 단계적으로 내 세포 식민지 형성의 메커니즘과 주파수를 포함 할 수있다 세포 행동을 측정하는 검사입니다. 단일 셀 추적은 개별 셀 수명과 세포 분열 패턴 조사 측정을위한 세포 운명지도를 생성하는 데 사용됩니다. 양적 데이터는 통계적으로 특정 유전 병변과 상관 행동에 상당한 차이를 평가하기 위해 분석하고 있습니다.
서론
유전 공학 마우스 모델은 공부하고 다른 유전자 병변이 유방암을 개발의 위험에 기여하는 방법을 이해하는 도구입니다. 예를 들어, 유전자 변형 마우스가 게재 한 광고 세 가지 요소의 조합 : 전체 길이 유방암 암 1, 초기 발병 (Brca1) 유방 상피 세포에서 유전자, 종양 단백질 p53의 (Tp53) 세균 라인 haploinsufficiency, 그리고 상피 유방의 손실 셀은 목표 상향 조절 에스트로겐 수용체 알파 Brca1 floxed (F) 11/f11/Mouse 유방 종양 바이러스 (MMTV) -Cre/p53 + / -/tetracycline-operator (의 100 %에서 유방암의 개발에 (시대) 식 결과 tet 조합) -ER/MMTV-reverse 테트라 사이클린 transactivator (Brca1 f11/f11/MMTV-Cre/p53에서보고 된 낮은 비율 + /에 비해 세 12 개월로 rtTA 쥐 - 시대없이 마우스 이상 표현 (~ 50 - 60 %)와 Tp53 haploinsuf없이 Brca1 f11/f11/MMTV-Cre 마우스ficiency (....
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프로토콜
1. 전체 계획
- 유전 공학의 유방 땀샘에서 preneoplastic 유방 상피 세포의 주요 문화를 생성하고 야생 형 생쥐을 관리 할 수 있습니다.
- 라이브 셀 이미지에게 최대 5 일에 Volocity 이미지 수집 소프트웨어 (버전 5.3.1, PerkinElmer, Waltham, MA)를 사용하여 매 15 분 캡처합니다.
- 타이밍 및 상피 세포 식민지 형성의 메커니즘, apoptosis의 입사 및 형태학의 변경 중단을 평가하기 위해 직접 시간 경과 이미지를 볼 수 있습니다.
- 에 생성 Volocity. TIFF 스택을 변환합니다. MetaMorph의 현미경 자동화 및 이미지 분석 소프트웨어 (분자 장치, LLC 서니 베일, CA) 및 이름 바꾸기 디지털 이미지 파일 (이름 바꾸기 2.1.6 사용하여 JPG 파일을 http://www.softpedia.com/get은 / 시스템 / 파일 관리 /-Rename.shtml ) Timm의 추적 도구 소프트웨어 (TTT,과의 호환성을 사용하도록 설정하는 방법tz-muenchen.de/en/....
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결과
상피 및 섬유 아세포 세포는 세포 형태에 의해 구별 할 수 있습니다. 상피 세포는 cuboidal 모양 (그림 1A-B) 및 양식 세포 식민지 (그림 1A)를 갖추고 있습니다. 섬유 아세포, stromal 세포의 종류, 가늘고 긴 형태 (그림 1C)을 갖추고 있습니다.
세포는 반올림 및 이미징의 시작 (그림 2A-D)에 떠 있었다. 플레이트에 부착 후에는 평면이되었고, cuboidal 형 모양 (그림 2E, H)를 보여 주었다. 문화 4 일까지 상피 세포의 대부분은 EMT과 같은 형태 (그림 2I-L)에 가늘고 긴. 이 변경 사항은 연구 모든 genotypes에서 동일한 연대기가 발생했습니다. Kohler 조명 및 위상 링 정렬이 제대로 설정합니다 (그림 2D, H, L)되지
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토론
중요 단계
그것은 유방 땀샘은 유방 상피 세포의 행동에 연령 관련 변화에 대한 제어 할 수있는 같은 시대의 마우스에서 수확되어 있는지 확인하는 것이 중요합니다. 세포를 도금 할 때, 셀의 동일한 번호가 모든 실험에 대한 각각의 우물에 도금해야합니다. 문화가 가능한 직렬 이미지를 통해 여러 개별 셀을 따르도록하고 너무 빨리 합류가되지 않도록 도금 할 때 세포는 상대적으로 희박한해야합니다. 이 플레이트는 equilibrated 후 포커스가 변경됩니다 때문에 접시 이미징 전에 보육에 equilibrated 것이 중요합니다. 일단 영상이 시작되었습니다 초점은 특히 첫 24 시간 이내에 자주 확인하고 필요에 따라 조정해야합니다. 이 보육 규제 및 사전 예열의 온도가 중요합니다. 방을 들락날락 사람들의 수는 가능한 한 제한해야합니다. 우리는 보인의 모든 측면을 연습하는 것이 좋습니다g 재현성 및 품질 관리를 보장하기 위해 사전에 실험까지. 모든 세포 배양 실험과 마찬가지로, 불임은 중요한.......
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공개 사항
제작자들은 더 경쟁 금융 이익이 없다는 점 선언합니다.
감사의 글
저자는 라이브 셀 이미징에 자신의 소개를 위해 기술 지원 및 마이클 Rieger에 Bofan 우와 기독교 Raithel 감사하고 싶습니다. NCI, NIH RO1CA112176 (PAF), NCI, NIH의 지원. R01CA89041-10S1 (PAF), Deutscher Akademischer Austaush Dienst EV A/09/72227 참조. 316 (REN), 국방부 W81XWH-11-1-0074 (REN), 교육 과학 기술부 (R31-10069)의 지원을받는 한국의 국립 연구 재단을 통해 WCU (세계 클래스 대학) 프로그램 (PAF ), NIH IG20 RR025828-01 (설치류 장벽 시설 장비), 그리고 NIH NCI 5P30CA051008 (현미경 및 이미징 및 동물 공유 자원).
....액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
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참고문헌
- Jones, L. P., et al. Activation of estrogen signaling pathways collaborates with loss of Brca1 to promote development of ERalpha-negative and ERalpha-positive mammary preneoplasia and cancer. Oncogene. 27, 794-802 (2008).
- Burga, L. N., et al.
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재인쇄 및 허가
