이 문서는 기본 셀 문화, 및 종양 세포에서 적혈구와 섬유 아세포의 contaminations를 제거하는 방법에 신선한 얻은 흑색 증 조직의 준비에 대해 설명합니다. 마지막으로, 우리는 어떻게 묘사 CD133 + putative 흑색 증의 줄기 세포는 CD133에서 정렬되어 - 자기 활성화 셀 정렬 (맥)를 사용하여 대량.
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이 논문에서
요약
초록
사용 가능한 흑색 증 오늘은 개선 치료 옵션에도 불구하고, 고급 악성 흑색 증 환자는 여전히 진행 무료 및 전반적인 생존 가난한 예후 (豫 后)가 있습니다. 따라서, 병진 연구는 악성 melanomas에 대한 타겟 치료를 개선하기 더 분자 증거를 제공해야합니다. 흑색 증에 관한 과거 종양 발생 메커니즘에 광범위하게 구축 된 세포 라인에서 공부했다. 각각의 유전자 프로파일에 따라 맞춤 치료 regimens로가는 길에, 우리는 환자 파생 세포 라인 대신 일반 세포 라인을 사용하여 제안합니다. 함께 특히 환자 후속에 대한 고품질의 임상 데이터와 함께 이러한 세포는 더 흑색 증의 진행 뒤에 분자 메커니즘을 이해하기 수단이 될 것입니다.
여기, 우리는 해부하는 새로운 종양 조직에서 기본 흑색 증 문화의 설립을 신고합니다. 이 절차는 하나의 셀에 날카과 조직의 분해, 재를 포함적혈구와 섬유 아세포뿐만 아니라 주요 문화와 세포 '흑색 증 원본을 신뢰할 수있는 인증과 contaminations의 moval.
최근 보고서 발표 그 melanomas, 종양의 대부분이 같은 항구 독점적으로 전이성 상태에 대한 종양 개시 및 진행을 연료 것 같습니다 암 줄기 세포 (CSCs)의 작은 subpopulation. 흑색 증의 CSC 식별 및 절연을위한 주요 마커 중 하나는 CD133입니다. 기본 흑색 증의 문화에서 CD133 + CSCs를 분리하기 위해, 우리는 수정과 자기가 활성화 된 셀 높은 정렬 순도의 결과로 Miltenyi에서 정렬 (맥) 절차와 CD133 + CSCs와 CD133의 생존 최적화 - 대량, 재배 및 기능적 분석 할 수 이후.
서론
피부 악성 melanomas 피부 암의 가장 일반적인, 아직 대부분의 치명적인 유형입니다. 증가 발생, 사망의 1,2을 관련 악성 피부 종양의 75 %를 종과 빠른 보급의 높은 학년, 지금 melanomas 계정으로 인해. 기본 종양, 화학 요법, 방사선 치료, immunotherapy와 metastasized 흑색 증의 결합 화학 및 immunotherapy의 수술 절단 외에 흑색 증 치료 3,4의 최신 전략입니다. 그러나, 악성 흑색 증은 chemotherapeutics에 가난한 응답 (5-12%) 5,6,하고 vemurafenib 7 치료 등 새로운 타겟 치료를 약속에서 BRAF V600E 유전자 변이 혜택을 들고 흑색 증 환자 만 50-70%에 의해 특징입니다 전체 생존을 개선, 흑색 증의 tumorigenesis의 메커니즘을 훨씬 더 이해가 필요합니다.
과거 잘 알려진 commer에 그 메커니즘을 연구하기 위해cially 가능한 셀 라인은 사용되었습니다. 암 개시 및 진행의 분자 이벤트를 공부하는 최근의 접근 방법은 종양 조직에서 직접 파생 된 주요 문화 활용 - 전략 베어링 매니 폴드 혜택을 : 연구원은 환자 및 조직 선택에 대한 모든 권한이 있습....
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프로토콜
기본 세포 배양, 섬유 아세포 고갈과 CD133의 자기 세포 정렬의 종양 조직, 특성의 기본 단일 세포의 준비를 포함하여 실험의 전체 계획은 +와 CD133 - 흑색 증 세포는 그림 1에 표시됩니다.
1. 샘플 취득
- 다음 단계를 고려하기 전에 윤리적 승인을 확인합니다.
- 멸균 PBS가 수술 또는 팀 이상 1퍼센트 페니실린 - 스트렙토 마이신 최종 농도와 손으로 보충과 함께 50 ML 튜브를 준비합니다.
- 4 ° C.에서 수술에서 세포 배양 연구소로 종양 조직의 빠른 전송을 구성
2. 종양 조직에서 기본 흑종 단일 세포를 준비
- 무균 조건 하에서 모든 단계를 수행합니다.
- 종양을 절제하기 전에, 하나는 해리 믹스를 준비해야합니다. 2-4g 조직 당 10 ML 해리 혼합이 필요합니다. 믹스는 immedia를 사용할 수 있습니다tely 또는 나중에 사용하기 위해 -20 ° C에서 10 ML aliquots에 저장됩니다.
- 150 밀리미터 나트륨 염화물을 포함하는 솔루션을 준비합니다. 솔루션이 명확 할 때까지 소용돌이....
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결과
종양 조직에서 단일 세포의 준비
그림 2 (A)와 (B) 기계 분리 한 후 2~4mm 조각에 전에 늦은 단계 흑색 증 환자의 resected의 림프절 전이의 실천. 70 μm 나일론 메쉬를 통해 조직과 여과의 효소 분해 후, 세포는 pelleted이었고 표면에 뜨는를 삭제했습니다. 이 단계에서 우리는 그림 2C의 셀 펠렛의 붉은 색으로 표시로 적혈구와 높은 오염을 관찰했다. 그 후, 우리는 밝은 갈색 색상 (그림 2D)의 세포 펠렛으로 이어진 붉은 혈액 세포를 고갈. 이러한 세포는 37 resuspended과 양자 263 매체 배양 된 ° C 5 % CO 2.
기본 셀 문화의 특성
세포가 종양에서 발생한 여부를 확인하고하지 기질 주변에서, 우리는 RT-PCR을 수행melano.......
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토론
종양 세포 펠렛에서 적혈구 contaminations를 제거하기 위해 우리는 매우 Miltenyi에서 적혈구 용해 용액을 사용하는 것이 좋습니다. 기존의 Ficoll 밀도 기울기 원심 분리를 통해 적혈구를 lysing의 장점은 빠르고 간단는 것입니다. 또한, Ficoll 또는 적혈구와 종양 세포의 손실과 contaminations을 피할 수 있습니다. 너무 오래 대기 할 때 일반적으로 종양 세포를 ...보다 빨리 자라다 이후이 기본 세포 배양에서 섬유 아세포의 성장을 관찰 할 때 즉시 제거해야합니다.
Miltenyi의 맥 기법으로 세포를 정렬 할 때 우리는 효소 세포를 수확하는 것이 좋습니다. 셀 스크레이퍼를 사용하면 세포와 표면 epitopes에 gentler 될 수 있지만, 맥 컬럼에 nonspecifically 바인딩하고 열을 방해 셀 조각을도를 생성합니다. 기존의 트립신 / EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) 치료를 통해 Accutase의 장점은 감소 세포 스트.......
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공개 사항
제작자들은 더 경쟁 금융 이익이 없다는 점 선언합니다.
감사의 글
저자는이 일을 지원하고 비판적으로 원고를 읽기 위해 교수 M. Dietel와 더크 슈마허 감사드립니다.
이러한 결과로 이어지는 연구 보조금 협정 N 아래의 혁신적인 의약품 사업 공동 인수 ° 115,234, 유럽 연합 (EU)의 7 번째 프레임 워크 프로그램 (FP7/2007-2013)와 EFPIA 회사 '에서의 금전적 인 기부로 구성되는 자원의 지원을받은 친절한 기여. 이 작품은 베를린 Krebsgesellschaft (BKG)에 의해 지원되었다.
....액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 시약 | |||
| Accutase | PAA Laboratories의 GmbH의 | L11-007 | |
| Amphotericin B 솔루션을 250 μg / 탈 이온수에 ML | 시그마 - 알드리치 주식회사 | A2942-50ml | |
| 안티 섬유 아세포의 microbeads | Miltenyi Biotec GmbH의 | 130-050-601 | |
| CD133 / 1 (W6B3C1) | Miltenyi Biotec GmbH의 | 130-092-395 | |
| Collagenase IV | 시그마 - 알드리치 주식회사 | C5138 | |
| DNase I | Applichem GmbH의 | A3778.0050 | |
| CA, MG없이 D-PBS | PAA Laboratories의 GmbH의 | H15-002 | |
| Ethylenediaminetetraacetic 산 나트륨 소금 탈수 (EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산)) | 시그마 - 알드리치 주식회사 | E-7889 | |
| FBS 수 페리 어 | Biochrom | S0615 | |
| 간접 CD133 마이크로 비드 키트 사람 | Miltenyi Biotec GmbH의 | 130-091-895 | 포함 : CD133 / 1 (AC133) 비오틴, 항 비오틴 MicroBeads 및 FcR 차단 시약 |
| 페니실린 - 스트렙토 마이신, 액체 (100x) | Invitrogen GmbH의 | 15140-122 | |
| 양자 263 | PAA Laboratories의 GmbH의 | U15-815 | |
| 적혈구 용해 용액 (10 배) | Miltenyi Biotec GmbH의 | 130-094-183 | |
| 장비 | |||
| 셀 스트레이너 (70 μm) | BD Biosciences | 352350 | |
| gentleMACS C 튜브 | Miltenyi Biotec GmbH의 | 130-093-237 | |
| gentleMACS dissociator | Miltenyi Biotec GmbH의 | 130-093-235 | |
| 맥 구분 기호 멀티 스탠드 | Miltenyi Biotec GmbH의 | 130-042-303 | |
| 맥 간격 열 25 LS 열 | Miltenyi Biotec GmbH의 | 130-042-401 | |
| MACSmix 튜브 회전하는 것 | Miltenyi Biotec GmbH의 | 130-090-753 | |
| Natriumchloride | 머크 KGaA | 567440-1KG | |
| 사전 분리 필터 | Miltenyi Biotec GmbH의 | 130-041-407 | |
| QuadroMACS 구분 | Miltenyi Biotec GmbH의 | 130-090-976 | |
| Rotilabo - 주사기 필터 (0.22 μm, PES) | 칼 로스 GmbH의 앤 컴퍼니 KG | P668.1 | |
| Steritop-GP 필터 유닛 500 ML | Miltenyi Biotec GmbH의 | SCGPS05RE |
참고문헌
- Garibyan, L., Fisher, D. E. How sunlight causes melanoma. Curr. Oncol. Rep. 12, 319-326 (2010).
- Radovic-Kovacevic, V., et al. Survival analysis in patients with cutaneous malignant melanoma. Srp. Arh. Celok. Lek. 125, 132-137 (1997).
- Lens, M. B., Eisen, T. G.
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재인쇄 및 허가
