이 절차는 성인 마우스 뇌 미토콘드리아 - 관련 ER의 멤브레인 또는 MAMs 및 MAMs과 mitochondrial 준비에서 glycosphingolipid 강화 microdomain 분수에서 분리하는 방법을 보여줍니다.
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방법 논문
미토콘드리아 - 관련 ER의 멤브레인 (MAMs)와 Glycosphingolipid 강화 Microdomains (보석) : 마우스 뇌에서 절연
* These authors contributed equally
이 논문에서
요약
초록
세포 세포 소기관은 모양과 셀 별 고유 및 외부 신호를 받게 아르 구성을 변화와 고도의 동적 구조입니다. 그들의 멤브레인은 종종 신호 분자와 막 구성 요소 1,2,3,4의 교환을위한 허브가 정의 연락처 사이트에서 juxtaposed 있습니다. endoplasmic 소포체 (ER)와 + 채널이 미토콘드리아 관련-ER 멤브레인 또는 MAMs 4,5,6로 알려져 있습니다 IP3에 민감한 칼슘 2 개구에서 미토콘드리아 사이에 형성되는 간 organellar 막 microdomains. 단백질 / 지질 조성과 이러한 멤브레인 연락처 사이트의 생화학 특성을 광범위하게 특히 세포 내 칼슘 2 + 4,5,6을 조절에서의 역할과 관련하여 연구되었습니다. ER은 +,이 용량에서 칼슘이 세포의 하류 공정의 무수한을 조절 세포 칼슘 (2)의 기본 저장소 역할을 + 신호, incl포스트 병진 단백질 접힘, 단백질 maturation7을 uding. 미토콘드리아, 다른 한편으로,이를 통해 하류 칼슘 2 + 불균형 4,8의 apoptotic 경로의 개시를 방지 cytosolic 칼슘 2 + 농도를 버퍼링하여 칼슘 2 + 항상성을 유지하고 있습니다. MAMs의 동적 특성은 그들에게 이상적인 사이트는 칼슘 2 + 신호와 mitochondrial 칼슘 2 + 농도, 지질 생합성 및 수송, 에너지 신진 대사와 세포 생존 4,9,10,11,12 규제 등의 기본적인 세포 메커니즘을 해부 할 수 있습니다. 여러 프로토콜은 간 조직 및 배양 세포 13,14에서 이러한 microdomains의 정화에 대한 설명되었습니다.
계정에 이전에 다음 ID로 출판 방법을 복용, 우리는 성인 마우스의 뇌에서 미토콘드리아와 MAMs의 절연을위한 프로토콜을 적응하고 있습니다. 이 절차에 우리는 추가 정화 단계, 즉 트리톤의 X100 추출을 추가하는 전자nables MAMs의 glycosphingolipid 강화 microdomain (GEM) 분수의 고립. 이러한 GEM의 준비가 플라즈마 막 나 다른 세포 세포막에서 유래 caveolae과 지질 보트와 여러 단백질 구성 요소를 공유하고 수용체 단백질의 클러스터링에 대한 포인트를 수집처럼 단백질 단백질 상호 작용 4,15에 대한 작동하도록 제안하고 있습니다.
프로토콜
다음 프로토콜은 마우스 뇌에서 MAMs과 보석의 절연 및 정화를위한 것입니다
솔루션은 미토콘드리아, MAMs와 보석의 절연이 필요
분류 원유 mitochondrial 준비를 얻기 위해 :
솔루션 A : 0.32 M의 자당, 1 MM NaHCO 3, 1 MM MgCl 2, 0.5 MM CaCl 2 + 프로테아제 저해제 (필요에 따라, 신선한 추가)
솔루션 B : 0.32 M의 자당, 1 MM NaHCO 3 + 프로테아제 저해제 (필요에 따라, 신선한 추가)
MAMs 절연 :
절연 매체 : 250 MM 마니 톨, 5 밀리미터 HEPES의 산도 7.4, 0.5 MM EGTA, 0.1 % BSA
그라디언트 버퍼 : 225 MM 마니 톨, 25 ....
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결과
우리가 안전하게 MAMs, 보석 및 마우스의 뇌에서 mitochondrial 분수의 절연 및 정화를 위해 추천 할 수 있습니다이 프로토콜을 사용하여와의 경험을 바탕으로. 명시된 절차는 매우 재현과 일치합니다. 그림 1에서 우리는 Percoll 기울기 (단계 3.4)의 방법으로 순수 미토콘드리아와 MAMs 층의 대표 이미지를 보여줍니다. 이맘 분율은 미토콘드리아 위의 확산과 폭 넓은 대역을 구성하는 동안 포함 된 정의, 우유 밴드, ultracentrifuge 튜브의 하단에있는 미토콘드리아 (미토 P) segregates를 정화. 개별 기울기 밴드의주의 회복 후, 정화 분수는 용해 버퍼에 resuspended 아르 SDS의 polyacrylamide 젤에서 분리 PVDF 막을에 blotted. Blots은 다음 분수와 단백질 성분의 순도를 확인합니다 특정 단백질 마커에 대한 항체의 배터리로 탐색합니다. 그림 2A는 cytos의 분포를 보여줍니다고립 된 MAMs과 mit.......
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토론
세포 멤브레인 간 또는 세포 소기관과 세포의 플라즈마 막 사이의 접촉의 사이트는 기본 세포 프로세스에 동적 신호 플랫폼을 나타냅니다. 생리학 및 병리학 조건 모두에 따라 자신의 기능과 구성의 정확한 특성은 안정적이고 재현 정화 프로토콜이 필요합니다. 여기에 설명 된 방법은 특별히 성인 마우스의 뇌에서 MAMs와 해당 보석의 절연 및 정화를 위해 우리 실험실에서 최적화되었습니다. 이 프로토콜이 성공적으로 어린이 4 neurodegenerative 신진 대사 질환에 neuronal 세포 사망에 이르는 + 불균형을이 microdomains을 지정하고, 칼슘 2의 apoptotic 경로의 하류를 기초 분자 effectors의 식별을 위해 구현되었습니다.
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공개 사항
저자는 모두 신고 할 관심의 충돌이 없습니다.
감사의 글
우리는 초기 프로토콜을 속에에 레 사노의 공헌을 인정합니다. Ad'A. 유전 및 유전자 치료에 의자를 부자 어린이 (JFC)의 보석상을 보유하고 있습니다. 이 작품은 NIH 보조금 GM60905, DK52025 및 CA021764, 그리고 미국의 레바논 시리아 관련 자선 단체 (ALSAC)에 의해 부분적으로 재정 지원을했습니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 시약 / 재료의 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 코멘트 |
| 시약 | |||
| 분류 | |||
| 자당 | 피셔 과학 | S5-500 | |
| 나트륨 중탄산염 | 시그마 - 알드리치 | S-5761 | |
| 염화 마그네슘, Hexahydrate | 피셔 과학 | BP214-500 | |
| 칼슘 염화물, 이수화 | 시그마 - 알드리치 | C-5080 | |
| 이맘 | |||
| D-마니 톨 | 시그마 - 알드리치 | M9546-250G | |
| Hepes | 피셔 과학 | BP310-500 | |
| EGTA | 시그마 - 알드리치 | E4378-250G | |
| BSA, 분수 V, 열 충격은 Lyophilizate | 로슈 | 03-116-964-001 | |
| Percoll | GE | 17-0891-02 | |
| GEM | |||
| 트리톤 X-100 | 시그마 - 알드리치 | T9284-500 ML | |
| 나트륨 염화물 | 피셔 과학 | S271-3 | |
| 트리스베이스 | 로슈 | 03-118-142-001 | |
| HCL | 피셔 과학 | A144S-500 | |
| EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) | 피셔 과학 | BP120-500 | |
| 나트륨 Dodecyl의 황산 (SDS) | 피셔 과학 | BP166-500 | |
| 공통의 | |||
| 전체 단백 분해 효소 저해제의 태블릿, EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) - 무료 | 로슈 | 11-873-580-001 | |
| 장비 | |||
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| Ultracentrifuge 튜브, 울트라 클리어, Thinwall, 14x89 mm | Beckman - 보습 바로 앞에 달린 풀 베는 날 | 344059 | |
| Parafilm | 콜 - Parmer | PM996 | |
| 일회용 붕규산 유리 파스퇴르 (Pasteur) Pipets, 9 " | 피셔 과학 | 13-678 - 20C |
참고문헌
- Poburko, D., Kuo, K. H., Dai, J., Lee, C. H., van Breemen, C. Organellar junctions promote targeted Ca2+ signaling in smooth muscle: why two membranes are better than one. Trends Pharmacol. Sci. 25 (1), 8-15 (2004).
- Pani, B., Ong, H. L., Liu, X., Rauser, K., Ambudkar, I. S., Singh, B. B.
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재인쇄 및 허가
