신속한 Colorimetric Assays는 질적 Biomolecular 샘플에서 RNA와 DNA를 구별 할

요약

colorimetric assays의 스위트 룸은 급속하게 구별 단백질, RNA, DNA, 그리고 잠재적으로 이기종 biomolecular 샘플에 다시 ducing 설탕에 설명되어 있습니다.

초록

생화학 실험은 일반적으로 잠재적 이기종 표본에 정확한 핵산의 초기 단계에서 지식,,, 단백질 및 기타 biomolecular 구성 요소가 필요합니다. 핵산이가 쉽게 구별 할 수 있지만 (예를 들어, _260), fluorometric (예, 형광 염료의 결합) 또는 colorimetric (뉴 클레오 사이드 별 chromogenic 화학 반응) ^1. 분광 아르 분석 방법 등 여러 설립 방식을 통해 감지 할 수 있습니다 RNA DNA에서 _260은 260 nm의 주로 280 nm의 가까이에 흡수 단백질, 근처에 주로 흡수 핵산의 상대적 내용의 간단하고 ^빠른이 평가를 제공으로 / A _280의 비율이 일반적으로 사용된다. 1.5 ^세 비율은 <순수 핵산 (NA)이 비율을 특징으로하는 동안 0.8는 '순수'단백질 표본을 나타내는로 이동합니다>.

호wever, 단백질 / NA 내용으로 명확하게하거나 안정적으로 간단한 UV-VIS 분광 측정에서 유추 할 수 없습니다있는 경우도 있습니다. 예를 들어,은 (i) 샘플 같은 일부 작은 RNA 결합 단백질의 경우는, ≈ 280 nm의 (TRP, 티르, Phe)에서 흡수에 책임이있는 향기로운 아미노산이 상대적으로 결여있는 하나 이상의 단백질을 포함하고 있습니다 (II) 샘플은 단백질 / NA 내용이 훨씬 덜 분명하다, 심지어 단백질과 NA 구성 요소 사이의 높은 친화력 협회가 반영 될 수 있습니다 중간 ₂₆₀ / A ₂₈₀ 비율을 (~ 0.8 <~ 1.5), 전시 할 수 있습니다. 이러한 시나리오의 경우, 우리는 빠르게 RNA, DNA, 그리고 분자의 잠재적 혼합 샘플에 설탕을 줄여을 구분하기 위해 본 colorimetric assays의 스위트 룸을 설명합니다. 방법은 베네딕트의에 pentoses 및 기타 탄수화물의 차동 감도에 의존 Bial의 (orcinol) 및 Dische의 (다이 페닐 아민) 시약은, 간소화 된 프로토콜은 COM 될 수 있습니다구성 요소를 분리해야하는 추가 단계없이 몇 분 만에 pleted. assays는뿐만 아니라 RNA와 DNA 사이의 구분과 같은 포도당, 과당, 그리고 리보오스 (그림 1)과 같은 무료 줄이고 설탕의 존재를 나타 내기 위해 병렬로 수행 할 수 있습니다.

서론

많은 세포 생물학은 DNA와 RNA를 포함하는 분자의 상호 작용을 통해 발생합니다. ^4이 자연적으로 발생하는 핵산은 (NAS) (예를 들어, 이가의 양이온 단백질, ⁶ 및 생체 내 작은 분자 화합물 및 리간드의 호스트와 함께 서로 ⁵ 상호 작용 ^7). 상호 작용이있을 수 있습니다 단기 또는 (kinetically) 수명이 긴, 낮은 친화력 (열역학적 힘)에 검토하기 위해 높은 곳에서 다양 할 수 있으며, 또한 화학 특성과 특이성에 상당한 변화를 전시 할 수 있습니다 - 일부 단체 (예, DNA 매우 구체적 · · · 전사 인자, RNA · · · 접합 요소), 다른 상호 작용 반드시 훨씬 더 일반적인하는 동안 (예를 들어, DNA · · · 세균 히스톤 같은 HU 단백질 ^8). NAS와 비 특정 상호 작용은 biomo의 혼합물을 포함하는 체외 실험에서에 대한 실질적인 결과를 가질 수lecules, 그건 일부 NAS가 적어도 사용되는 실험 조건의 일부 하위 집합 (이온 강도, 솔루션 산도 등)에 따라, 관심있는 분자와 연관 될 가능, 심지어 가능성이 있습니다.

프로토콜

1. 슈 거즈를 감소시키기위한 베네딕트의 분석

1. 940 MM 무수 탄산 소다, 588 MM 나트륨 구연산의 탈수, 68 MM 구리 (II) 황산염의 pentahydrate - 베네딕트의 시약의 적절한 수량을 준비합니다. 이 시약은 반응성에 더 눈에 띄는 변화 6 개월 이상 실온 (RT)에 저장할 수 있습니다.
2. 위의 시약은 6x입니다. 샘플 assayed 할 당 따라서, 600 μl 반응에 대해, 깨끗한 1.5 ML의 microcentrifuge 튜브 (예를 들어, Eppendorf 브랜드)에 베네딕트의 시약 100 μl를 추가합니다.
3. 10 μl에서 튜브에 샘플 500 μl에 아무 곳이나 추가, 최적의 볼륨이 초기 시운전에 색 형성의 강도에 따라 결정될 수있다. 충분한 샘플을 사용할 수 있다면 다음 assays에 희석 한 후 최대 가능한 샘플 볼륨 (즉, 전체 반응 양의 다섯 6 이죠,이 경우 샘플 500 μl)에서 이러한 실험을 시작합니다.
4. 부엉에 ddH ₂ O를 추가합니다vortexing 또는 pipetting하여 솔루션을 혼합 600 μl에 최종 볼륨을 가지고하는 것입니다.
5. 끓는 물 목욕에 20 분의 샘플을 품다.
6. 목욕탕에서 온수....

결과

결과는 알려진 참조 화합물에 이러한 colorimetric assays의 응용 프로그램에 대한 그림 3에 표시됩니다. 대표 질적 데이터는 베네딕트의 (A), Bial의 orcinol (B), 그리고 Dische의 다이 페닐 아민 (C) assays에 표시되며,이 세 assays에 대한 표준 곡선은 그림 4에 표시됩니다. 패널 3 (AC)에서, 왼쪽 패널은 적절히 반응 / unreactive analytes를 사용하여 부정적인 / 긍정적 인 제어 실험을 표시, 프로토콜 1-3 (위)에 설명 된대로 이러한 시각적 결과는 큐벳에 원위치에 표시됩니다. 하위 패널 권리는 각각의 analyte의 적정 시리즈를 보여줍니다. 부정적인 컨트롤 물, 일반적인 단백질 (0.75 MG / ML BSA)과 0.75 두 개의 비 감소 당분 (DNA 반면 베네딕트의 분석 (A)에서 긍정적 인 컨트롤, 리보오스 (0.42 MG / ML)입니다 MG / ML 와 RNA 12.5에서.......

토론

colorimetric assays는 빠른 속도 등 자세한 연구를위한 준비 단백질, RNAs 또는 전체 셀 lysate에서 복합체를 정화 할 때 발생하는 등 biomolecular 혼합물의 화학 특성을 평가하기 위해 간단한 방법을 제공합니다 여기에 제시했다. 구조 생물학 이러한 샘플 이질성으로 더 네이티브처럼 어셈블리, 점진적으로 더 큰 도전을 추구으로 복잡하고 다중 구성 요소 단지로 인한 것입니다. Supramolecular 어셈블리 주로 영특 안정적이며, 성공적인 고립는 (예를 들어, 같은 spliceosomal snRNP 단지 ^17,18를 찾을 수) 덜 엄격한 정화 조건을 요구 할 수 있습니다. 이러한 milder 조건에서 모두 정통과 가짜 POI · · · NA 상호 작용은 대상 단백질이나 핵산과 하류 assays에 계속함으로써 방해 할 가능성이 더욱 높아집니다. 필요한 첫 번째 단계는 이러한 샘플의 화학 구성 요소의 유형을 식별합니다.

RNA, DNA, 그리고 단백.......

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
시약이나 장비	공급 업체 / 회사	카탈로그 번호	코멘트, 메모
무수 탄산 소다	피셔 과학	S263
나트륨 시트르산 이수화	시그마	S-4641
구리 (II) 황산염의 pentahydrate	VWR	VW3312-2
Orcinol 수화물	시그마 - 알드리치	O1875
집중 HCL	VWR	BDH3030
철 염화물 hexahydrate	시그마	F-2877
다이 페닐 아민	올드리치	112763
빙하 아세트산	피셔 과학	대답 28
황산	시그마 - 알드리치	258105
에탄올	Koptec	V1101
리보오스	시그마	R-7500	1퍼센트에서 사립 w / H 2 O의 V
베이커의 효모에서 Ribonucleic 산성 (S. cerevisiae)	시그마	R6750	H 2 O의 10 MG / ML에서 시험을 치루, -20 ° C에서 저장
송아지 thymus에서 데 옥시 리보 핵산 (나트륨 소금),	시그마	D1501	H 2 O의 10 MG / ML에서 시험을 치루, 4 ° C에서 저장
			시약, 장비 및 안전 재료는 강한에 나열되어 있습니다그들은 프로토콜 섹션에 표시되는 순서대로 테이블을 llowing. 기타 (위) 언급하지 않는 한, 모든 시약은 주변 실내 온도 및 조명에 저장할 수 있습니다. (예를 들어, microcentrifuge 튜브) 아래에 나열되어 있지 항목은 일반적인 제조사 / 모델 / 다양한 표준 생화학 실험실에서 발견이 (예를 들어, Eppendorf 브랜드 1.5 ML microfuge 튜브) 사용할 수 있습니다. 표준 플라스틱 microfuge 튜브는 원심 분리 (예를 들면, 각 프로토콜의 끝 부분 침전물 미립자 자료에)와 관련된 단계에 사용되어야합니다. 튜브는 밀봉 할 수있는 한 특별한 재료는 것이 좋습니다없고, 생화학 실험실에있는 일반적인 폴리 프로필렌 튜브가 잘 작동합니다. 안전 우려와 폐기물 처리의 측면에서 표준 실험실주의 사항은 (안전 안경, 연기 후드)와 협력, 그리고 농축 아세트산, 염산 또는 황산 산을 포함하는 솔루션을 처분 사전 벗긴 껍질에서 행사되어야한다. 같은 유기 시약에 대한 orcinol 또는 diphenylamine, 니트릴 장갑은 일반적인 라텍스 (천연 고무) 다양한 바람직합니다.