의 주문형 정량 분석​​을위한 미세 유체 기반 Electrotaxis Caenorhabditis의 엘레 '로코

Summary

에 주문형 운동을 유도하는 반자동 마이크로 전기 유체 방법 Caenorhabditis의 엘레이 설명되어 있습니다. 이 방법은 미세 유체 채널 내부에 약한 전기 필드 ( "electrotaxis")에 응답 벌레의 neurophysiologic 현상을 기반으로합니다. 미세 electrotaxis는 신경 세포 건강에 영향을 미치는 요인 화면으로 신속하고 민감한, 낮은 비용, 확장 성이 뛰어난 기술로 제공합니다.

Abstract

선충 Caenorhabditis의 elegans의 때문에 질병 관련 유전자와 경로뿐만 아니라 재배의 용이성 자사의 보존 생물 의학 연구를위한 다양한 모델 생물이다. 여러 C. 엘레 질병 모델은 같은 도파민 (DA) 뉴런 ^1의 변성을 포함 파킨슨 병 (PD)와 같은 퇴행성 신경 질환 등이보고되었다. 도입 유전자와 신경 독성 화학 물질을 모두 신경 변성 및 신경 유전자와 화합물을 ^2,3에 대한 화면의 기초로 조사를 허용, DA의 신경 퇴화 및 웜의 필연적 인 움직임 결함을 유도하는 데 사용되었습니다.

C. 같은 낮은 진핵 생물의 화면 엘레은 신경 신호에 영향을 미치는 화합물 유전자를 식별 할 수있는 효율적이고 경제적 인 방법을 제공합니다. 기존의 스크린은 일반적으로 수동으로 수행하고 육안 검사에 의해 채점, 결과적으로, 그들은 시간이 단점입니다uming과 인간의 오류가 발생하기 쉬운. 또한, 세포 수준 분석에 대부분의 초점은 운동을 무시하면서, 이는 운동 장애를위한 특히 중요한 매개 변수입니다.

우리는 C.를 제어하고 정량화 새로운 마이크로 유체 심사 시스템 (그림 1) 개발 elegans의 '운동은 마이크로 내부 전기장 자극을 사용하여. 우리는 직류 (DC) 필드가 견고 음극쪽으로 운동 ( ^{"electrotaxis"4)} 주문형 유도 할 수있는 것으로 나타났습니다. 필드의 극성을 반전하면 웜이 빠르게뿐만 아니라 방향을 반전됩니다. 우리는 또한 도파민과 다른 감각 뉴런에 결함이 수영 응답 ^5을 변경 것으로 나타났습니다. 따라서 신경 세포의 신호 전달에 이상이 읽기 아웃으로 운동을 사용하여 확인할 수 있습니다. 운동 반응은 정확히 같은 속도, 몸을 구부리는 주파수와 반전 시간을 수영과 같은 매개 변수의 범위를 사용하여 정량화 할 수있다.

4에 비해 더 빠르게 이동합니다. 이러한 연구 결과는 우리가 수동적으로 연령과 표현형 ^(6)에 의해 벌레를 정렬하는 새로운 microfluidic 장치를 설계했다.

우리는 또한 펄스 DC에 웜의 반응을 테스트하고 전류 (AC) 전기 분야를 교류했다. C. 둘 다에있는 다양한 듀티 사이클 펄스 DC 필드 효과적으로 생성 electrotaxis 엘레과 사촌 C. ⁷ briggsae. 또 다른 실험에서, 1 Hz에서에서 3 kHz의 주파수 범위 대칭 AC 필드는 ⁸ 채널 내부의 벌레를 고정.

미세 환경에서 전기장의 구현은 electrotaxis 분석의 신속하고 자동 실행을 할 수 있습니다. 이 방법은 요소에 대한 높은 처리량 유전 및 화학 화면을 촉진하기 위해 약속신경 세포의 기능과 생존에 영향을 미치는.

Protocol

1. 마스터 금형 제작을위한 포토 리소그래피

1. 30 초 후 30 초와 메탄올 아세톤 실리콘 웨이퍼 인치 3 목욕. 5 분 dH보다 ₂ 0 물로 씻어.
2. N2 블로우 총으로 웨이퍼의 표면을 건조. 2 분 동안 140 ° C에서 뜨거운 접시에 웨이퍼를 가열한다.
3. 플라즈마 실리콘 웨이퍼 (1 분, 50 W)의 표면을 산화.
4. 3 ML SU-8 100 포토 레지스트 (; 1,750 rpm으로 40 초)을 스핀 코팅 웨이퍼의 표면.
5. 65 뜨거운 접시에 미리 구워 코팅 웨이퍼 ° C 10 분 후, 95 ° C 2 분 이상 온도를 진입로. 추가 1 시간이 설정을 유지합니다.
6. 원하는 채널 설계를 포함하는 포토 마스크를 맞 춥니 다. 550-600 UV 빛의 엠제이 ^/ ㎠ (350-400 nm의)에 저항을 노출합니다. 포토 마스크는 AutoCAD에서 설계 및 고해상도 인쇄와 투명에 인쇄 할 수 있습니다.
7. T를 올렸에서 10 분 동안 1 분, 95 ° C, 65 ° C에서 뜨거운 접시에 웨이퍼 포스트 구워이전과 그 온도.
8. 15 분 SU-8 개발자 용액에 웨이퍼를 담가. 이소프로판올로 세척함으로써 개발 완료를 확인합니다. 백색의 침전....

Results

웜 추적 소프트웨어에서 야생형 젊은 성인 선충의 electrotaxis 그 위치와 속도 출력의 대표적인 비디오 보충 비디오 1과 그림 3에 나와 있습니다. 동작 분석 소프트웨어 자체 필드 극성의 방향 및 극성 반전의 시간을 인식하지 않고 오히려이 정보는 소스 비디오에서 얻을 수 있어야합니다. 이 동영상의 오디오 또는 시각적 신호를 사용하거나 실험 조건 및 조작을 작성 할 수 있습니다.

야생형 (N2) 및 형질 전환 동물 (NL5901)의 집합에서 Electrotaxis 속도 데이터는 그림 4에 표시됩니다. NL5901 동물 UNC-54 (마이 오신 중쇄 유전자) 발기인의 통제하에 인간 α-synuclein의 유전자를 가지고. 몸에 α-synuclein의 표현 벽 근육 집계 ⁹ 우리의 결과는 ELEC에 이상이 발생한다는 것을 보여trotactic 응답.......

Discussion

처음으로 추앙와 동료 ^11,12의 dielectrophoretic 조작 작업에 GABEL 및 동료와 건물에 의해 기술 된 행동 현상을 활용, 우리의 마이크로 유체 기반 electrotaxis 분석은 운동을 같이 사용하여 웜에 신경 활동을 조사하기 쉽고 강력하고 중요한 방법을 제공합니다 출력. 운동 매개 변수의 분석은 서로 다른 유전자형 사이의 정량적 인 비교를 할 수 있습니다. 함께 마이크로 제조 및 전기 분야의 응용 프로그램의 정밀도는 제어 환경 운동 제어를위한 웜과 통신 할 수있는 수단을 모두 제공합니다. 다른 전기 신호의 파형 모양 웜의 여러 행동 반사가 두 자극하고 운동을 억제하는 데 사용되었습니다.

현재 microfluidic 장치의 단일 채널 디자인은 하나의 웜이 시간에 득점해야합니다. 이를 위해, 웜 솔루션은 충분히 M9로 희석해야합니다채널에 벌레를로드하기 전에 버퍼입니다. 그것은 채널 작업이 기포와 수압에 영향을 미치는 다른 부정의 존재에 의.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
아세톤	CALEDON Labs	1200-1-30
메탄올	CALEDON Labs	6700-1-30
이소프로판올	CALEDON Labs	8600-1-40
SU-8	Microchem Corp.	Y131273	SU-8 100
SU-8 개발자	Microchem Corp.
92x16mm 페트리 접시	Sarstedt	82.1473.001
Sylgard 184 실리콘 엘라스토머 키트	다우 코닝		엘라스토머 베이스 및 경화제 포함
기능 발생기	Tektronix Inc.		모델 AFG3022B
앰프	Trek Inc.		모델 2210-CE
주사기 펌프	Harvard 장치	70-4506	모델 11 ELITE
핫플레이트	Fisher Scientific	11675916Q	모델 HP131725Q