프라이머 확장 (SHAPE)에 의해 분석 높은 처리량의 선택 2 '수산기 실화는 단일 염기 해상도에서 수천 개의 뉴클레오티드로 수백에서의 RNA 구조를 결정하는 기술을 프로빙 소설 화학, 역전사, 모세관 전기 영동 및 이차 구조 예측 소프트웨어를 사용합니다.
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방법 논문
높은 처리량 SHAPE를 사용하여 RNA 이차 구조 예측
* These authors contributed equally
이 논문에서
요약
초록
생물 학적 과정에 관여 RNA의 기능을 이해하는 것은 RNA 구조의 철저한 지식이 필요합니다. 이를 위해, 불리는 방법은, 또는 모양 "프라이머 확장하여 분석 높은 처리량의 선택 2 '수산기 실화는"단일 염기 해상도를 가진 RNA 이차 구조 예측을 할 수 있습니다. 이 방법은 우선적으로 수용액 RNA의 단일 좌초 또는 유연한 지역 acylate 화학 프로빙 에이전트를 사용합니다. 화학적 변형의 사이트는 수정 된 RNA의 역전사에 의해 감지하고,이 반응의 제품은 자동화 된 모세관 전기 영동 (CE)에 의해 분별입니다 수 있습니다. 역전사 효소는 SHAPE 시약에 의해 수정하는 RNA의 뉴클레오티드에서 일시 정지하기 때문에, 결과의 cDNA 라이브러리는 간접적으로 하나의 접힌 RNA의 맥락에서 좌초하는 리보 뉴클레오타이드를 매핑합니다. ShapeFinder 소프트웨어를 사용하여 자동화 CE에 의해 생성 된 electropherograms가 처리되고 뉴로 변환cleotide 반응성 테이블은 그 자체가 RNAStructure (V5.3) 예측 알고리즘에 사용 된 의사 에너지 제약 조건으로 변환됩니다. 실리코 RNA 이차 구조 예측에서와 프로브 형상을 결합하여 얻은 두 가지 차원 RNA 구조는 혼자 두 방법을 사용하여 얻은 구조보다 훨씬 더 정확한 것으로 판명되었다.
서론
접합, 번역, 바이러스 복제 및 암의 조절에 관여 촉매 및 비 코딩 RNA를의 기능을 이해하기 위해, RNA 구조의 상세한 지식은 1,2 필요합니다. 불행하게도, RNA 접이식의 정확한 예측은 강력한 도전을 선물한다. 고전 프로빙 에이전트는 고통과 같은 독성, 불완전 염기 범위 및 / 또는 실험 당 100 ~ 150 뉴클레오티드 제한 처리 등 많은 단점에서. 남의 차 구조 예측 알고리즘은 유사하게 불리한 효율적으로 정력적으로 유사한 구조를 구별하기 위해 무능력으로 인한 부정확성으로 인해 수 있습니다. 특히 큰 RNA를 또한 X-선 결정학과 구조적 유연성과 이러한 기술에 필요한 고순도 샘플을 대량으로 인해 분광법 (NMR) 공명 핵 자기와 같은 3D 구조를 결정하는 방법을 자주 내화물입니다.
H고등학교의 처리량 모양의 단일 염기 해상도로 대형의 RNA 구조를 프로빙에 효과적인 간단한 방법을 제공함으로써 많은 문제를 해결합니다. 또한, 모양에 사용되는 시약 처리 안전, 쉽고, 시약 프로브 대부분의 다른 화학 대조적으로, 네 개의 리보 뉴클레오티드로 반응합니다. 이 시약은 또한 가능한 생체 컨텍스트 (들) 3 자신의 RNA를을 조사하기 위해 만들어 세포막을 통과 할 수 있습....
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프로토콜
RNA 3 '말단의 프라이머 설계 및 확장
높은 처리량 모양으로 긴 RNA를 분석하기 위해 프라이머 하이브리드 사이트의 시리즈는 그들이 (I) (II) (III)는 RNA / 길이 20 ~ 30 NT를, 그리고 ~ 300 NT에서 분리되는 등 선택해야합니다 이 사이트에 DNA를 열처리에 의해 만들어진 DNA의 하이브리드> 50 ° C.의 예상 용융 온도가 이러한 결정은 종종 사용할 수 없습니다 RNA 구조의 일부 예지를 필요로하고 있지만, 또한 고도로 구조화 될 것으로 예상되는 RNA의 세그먼트는 피해야한다. 이 사이트에 잡종 DNA 프라이머는 다음 그들은 안정적인 이합체 또는 intrastrand 차 구조를 형성 할 것으로 예상되지 않을 수 있도록주의하여 설계되어야한다.
일단 설계, 프라이머 세트는 하나 구입 (통합 DNA 기술, 에임스, 아이오와의 예) 또는 24.25을 합성해야합니다. 프라이머, Cy5에, Cy5.5와 5'는 - 라벨WellRedD2 (Beckman 보습 바로 앞에 달린 풀 베는 날)와 IRDye800 (Lycor) / WellRedD1 (Beckman 보습 바로 앞에 달린 풀 베는 날)이 가장 혼선을 최소화하면서 좋은 신....
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결과
RNA가 존재 HIV-1 회전 반응 요소 (RRE)과는 3 '말단 구조 카세트 4가 37 난방, 냉각, 및 배양 접힌 된 후, 관내 전사에 의해 선형화 된 플라스미드의 제조 하였다 ° C를 포함 MgCl 2. RNA는 NMIA에 노출 된 후 3 '말단 구조 카세트에 하이브리드 말단 표지 된 DNA 프라이머로부터 역전사. 결과 모양의 cDNA 라이브러리를 함께 제어 및 시퀀싱 반응으로, 다음 그림 4에 나와 electropherogram을 생산하기 위해 베크 만 보습 바로 앞에 달린 풀 베는 CEQ 8000 자동화 된 모세관 전기 영동 시스템을 사용하여 분획 하였다. 다음과 같은 네 가지 중복, 컬러 코딩 된 흔적은 모세관을 통해 반응 생성물의 네 가지 세트의 이주에 의해 생성됩니다 : 블루 (NMIA - 수정의 RNA 역전사에서 생성 Cy5에 레테르를 붙인 RT 제품), 녹색 (Cy5.5-표지 에서 RT 제품은 접혀 있지만, 그.......
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토론
우리는 여기서 높은 처리량 SHAPE에 대한 자세한 프로토콜, 어떤 크기의 RNA를위한 단일 염기 해상도로 차 구조 결정을 할 수있는 기법을 제시한다. 또한, 이차 구조 예측 알고리즘을 실험 SHAPE 데이터를 결합하는 것은 혼자 두 방법으로 가능한 것보다 높은 정확도와 RNA 차원 모델의 생성을 촉진한다. 찬란 - 라벨 프라이머 및 자동 CE의 조합은 하나의 실험에서 긴 RNA 시퀀스의 해상도를 촉진 기존의 젤 기반의 모양에 비해 상당한 장점뿐만 아니라, 여러 실험 상당히 높은 속도와 처리량을 제공합니다. 적합한 데이터 분석 도구의이 방법과 가용성의 편의 구조적 이전에 어려운 바이러스, 손상 메신저의 분석 및 비 암호화 RNA를 위해 이상적으로 적합한 모양을 만든다. 이 흥미로운 RNA를의 2D 구조는 명확 해짐에 따라, 하이드 록실 라디칼의 사용을 통해 - 스파, 프로빙세륨 절단 방법과 분자 모델링은 복잡한 차 상호 작용을 명료하게하는 데 도움이 결국 연구진은 세 가지 차원에서 이들의 RNA 구조를 결정할 수 있도록해야한다.......
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공개 사항
관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.
감사의 글
S. Lusvarghi, J. Sztuba-Solinska, KJ Purzycka, JW Rausch의 및 SFJ 르 Grice는 국립 암 연구소, 건강의 국립 연구소, 미국의 교내 연구 프로그램에 의해 지원됩니다.
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재료
EQUIPMENT
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| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| REAGENTS | |||
| strong>N-methylisatoic anhydride (NMIA) | Life technologies | M25 | Dissolve in anhydrous DMSO |
| 1-methyl-t-nitroisatoic anhydride (1M7) | 참조 22 | ||
| Superscript III Reverse Transcriptase | Life technologies | 18080044 | 10,000 units |
| Thermo sequenase cycle sequencing kit | Affymetrix | 78500 | |
| 사용자가 제공 한 재료< / strong> | |||
| RNA 반응 | 당 6 pmol (검출 한계는 기기에 의해 결정됨) | ||
| 4 개의 5 '라벨링 프라이머 세트 (Cy5, Cy5.5, WellRed D2 및 WellRed D1 / Licor IR800) | 프라이머는 RNA를 보완하며 역전사 및 염기서열분석 반응에 사용됩니다. 나열된 형광단은 Beckman Coulter 8000 CEQ에 최적입니다. 프라이머는 사내에서 구입하거나 합성할 수 있습니다. | ||
| DNA 주형 | DNA는 염기서열분석 반응에 사용되며, 3' 말단 확장(존재하는 경우)을 포함하여 연구 중인 RNA의 염기서열을 포함해야 합니다. 해당되는 경우, RNA transcription template를 사용하는 것이 편리한 경우가 많습니다. | ||
| Buffers | |||
| 10x RNA renaturation buffer | 100 mM Tris-HCl pH 8.0, 1 M KCl, 1 mM EDTA | ||
| 5X RNA 접힘 버퍼 | 200 mM Tris-HCl pH 8.0, 25 mM MgCl2, 2.5 mM EDTA, 650 mM KCl. (이 버퍼는 경우에 따라 변경될 수 있습니다 (예: pH, EDTA, Mg, RNase inhibitor) | ||
| 2.5X RT mix | 4 μ l 5X 버퍼, 1 μ l 100 mM DTT, 1.5 μ l 물, 1 μ l 10 mM dNTPs, 0.5 μ l 위첨자 III. 5X 버퍼 및 100mM DTT는 SuperScript III(Invitrogen) 구매 시 제공됩니다. | ||
| GenomeLab 시료 로딩 솔루션(Beckman Coulter) | Attention: 여러 번의 동결-해동 주기를 피하십시오< | ||
| Capillary 전기영동 | Beckman | CEQ8000 | |
| Thermocycler | 는 다양합니다. | ||
참고문헌
- Scott, W. G., Martick, M., Chi, Y. I. Structure and function of regulatory RNA elements: ribozymes that regulate gene expression. Biochim. Biophys. Acta. 1789, 634-641 (2009).
- Moore, P. B., Steitz, T. A. The roles of RNA in the synthesis of protein. Cold Spring Harb. Perspect. Biol.....
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재인쇄 및 허가
