사용 모니터링 수지상 세포 이동<sup&gt; 19</sup&gt; F /<sup&gt; 1</sup&gt; H 자기 공명 영상

요약

MRI를 사용하여 세포 추적 지난 몇 년 동안 괄목할만한 주목을 받고있다. 이 프로토콜은 불소와 수지상 세포의 라벨 설명 ( ¹⁹ F)이 풍부한 이들 세포의 생체 내 응용 프로그램에서 입자와 함께 배수 림프절에 그들의 마이 그 레이션의 정도를 모니터링 ¹⁹ F / ¹ H MRI와 ¹⁹ F MRS.

초록

이러한 자기 공명 영상 (MRI)와 같은 비 침습적 영상 기법의 지속적인 발전은 크게 살아있는 유기체의 생리 학적 또는 병리학 적 과정을 연구하는 능력을 개선했습니다. MRI는 생체 내 이식 된 세포를 캡처를위한 유용한 도구로 증명된다. MR 휴식 시간에 영향을 미치는 조영제 MRI 만들어 사용 초기 셀 라벨 전략 (T1, T2, T2 *)와 라벨 세포가 존재하는 신호의 향상 (T1) 또는 고갈 (T2 *)로 이어집니다. T2와 같은 초소형 산화철 에이전트 (USPIO) 등 * 개선 에이전트는 세포 이동 및 일부도 임상 적 적용을위한 FDA에 의해 승인 된 공부를하기 위해 고용되었다. T2 * 에이전트의 단점은 혈전, 마이크로 출혈이나 기포와 같은 다른 아티팩트의 표시 세포에 의해 생성 된 신호 멸종을 구별하는 어려움이있다. 이 문서에서는, 우리는 생체 내 추적 세포에 대한 새로운 기술을 설명하는불소 ⁽¹⁹ F) 부유 입자와 세포를 라벨링을 기반으로합니다. 이러한 입자는 퍼 플루오르 카본 (PFC) 화합물을 유화하고 이후 MRI ¹⁹ F로 군데 할 수있는 레이블 세포를 사용하여 준비가되어 있습니다. 생체 포함 (I) 후 ¹⁹ F MR 분광법에 의해 세포 신호를 정량화하는 배경이없는 이미지와 완전한 세포 selectivityand (II)의 가능성을 산출 생체 내 탄소 결합 ¹⁹ F,의 부재에서 세포 추적을위한 PFCs의 중요한 장점 .

서론

생체 내에서 세포의 추적 생물 의약의 여러 분야에서 중요한 측면이다. 이 경우, 선택적으로 일정 기간 동안 세포를 지역화 할 수 있습니다 비침 투 이미징 기술은 매우 가치가있다. 세 가지 차원 자기 공명 영상 (MRI)의 개발에 앞서, 면역 세포 이동의 추적 현미경 분석 또는 조직 생검에 국한되었다. MRI의 도움으로 세포 추적은 생체 내에서 면역 세포의 행동을 연구 면역을 위해뿐만 아니라, 지난 몇 년 동안 엄청난 주목을 받았다뿐만 아니라, 임상 및 줄기 세포 연구자있다. 90 년대 중반 동안, 산화철의 첫 번째 연구는 ¹ MRI로 추적 셀 개발의 폭포를 시작 나노 입자. 산화철 입자는 레이블 세포의 MR 휴식 시간 (T2 *) 단축함으로써 MR 영상에서 신호 고갈의 원인이됩니다. 산화철 입자는 라벨 식세포 ^2, 희소 돌기 아교 세포 P로 사용되어왔다rogenitors ³ 그리고 많은 다른 세포 유형. 이들 입자 중 일부는 임상 흑색 종 환자 ⁴ 세포 백신을 라벨에 대한 FDA에 의해 승인되었습니다. 생체 또는 철 산화물 입자와 세포의 생체 라벨링 때문에 T2 * 신호의 단축에 의존하고 후자는 같은 마이크로 출혈, 철의 예금이나 기포 등의 ....

프로토콜

모든 동물의 절차를 수행하기 전에 지역 기관 동물 복지위원회의 승인을 받아야한다. MR 측정시 마취 및 생리 학적 모니터링의 적절한 수준 (체온, 호흡 속도) 필수 요구 사항입니다.

1. 마우스 골수 유래 수지상 세포의 생성

1. C57BL에서 골수 세포를 추출 / 6 마우스는 이전 ¹² 설명했다.이 프로토콜은 다시 1992 ¹³ 날짜 원래 랄프 M. Steinman (1,943에서 2,011 사이), 수지상 세포 ^(14)의 발견의 그룹에 의해 설명되었다.
2. 간단히, 쥐를 희생 직후 경골과 비골의 압축을 풉니 다. 층류 후드 (미생물 오염을 방지하기 위해)에서 작동, 세척 매체 (5 % FBS, RPMI 1 % 페니실린 / 스트렙토 마이신, 1 % HEPES) ^12와 작은 페트리 접시에 골수를 플러시.
3. 셀 스트라 통해 세포 현탁액을 전송iner (100 μm의 메쉬 크기, 나일론) 멸균 50 ML의 원심 분리기 튜브에 뼈와 남은 조직을 제거하기 위해합니다. 몇 가지 세척 단계와 용해 단계 ¹² 이후 판 블루와 혈구를 사용하여 가능한 세포를 계산합니다.

결과

피내 응용 프로그램에 다음과 같은 여덟에 이십일시간는 ¹⁹ F-라벨 돌기 세포 (DC)의 배수 오금 림프절로 마이그레이션 할 수 있습니다. 배수 politeal 림프절로 림프 덕트를 통해 DC의 움직임은 ¹⁹ F DC의 이미지 (그림 2A)와 ¹ H 해부 영상을 중첩에 의해 평가 될 수있다. 우리는 이전에 생체 내에서 이러한 세포의 이동뿐만 아니라, 흡수 효율 ¹¹ 등 DC immunobiology에 ¹⁹ F-입자 크기의 영향에보고했다. 림프절에 DC 마이그레이션의 범위를 정량화하기 위해, 우리는 림프절을 추출하고 ¹⁹ F MRS (그림 2B) 수행합니다. 우리는 우리가 추론 할 수있는 동일한 PFCE 입자 (교정 곡선 그림 2C)으로 표시 DC의 서로 다른 숫자에서 얻은 ¹⁹ F 신호.......

토론

¹⁹ F / ¹ H MRI는 림프 노드에 DC의 움직임에 따라 고용이 방법은 생체 내에서 면역 세포의 이동 패턴을 연구 할 수있는 기회를 제공합니다. 수지상 세포는 빠르게 단단히 특정 기판에 ¹⁷ 준수하지 않고 입체 구조를 통해 기동 할 수있는 면역 세포를 마이그레이션 훌륭한 예입니다. 기술 기술의 낮은 공간 해상도 (μm의 범위)이 기술로, 다중 광자 현미경으로 얻을 수있는 높은 해상도 (nm의 범위)와 비교할 수 없습니다 비록 생체에 이상 세포 이동의 특성을 연구하기 위해 여전히 가능합니다 시간의 긴 기간. 또한, 현미경은 살아있는 유기체 내에서 이미지 큰 지역은 현재 적합하고, 제한된 깊이 침투보기의 제한된 필드가 있습니다.

기술의 noninvasiveness 때문에, 그것은 몬 가능합니다조사 후에 마우스를 희생하지 않고 하세 몇 일 동안 면역 세포의 이동을. 기술의 또 다른 장점.......

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
REAGENTS
>C57BL/6 마우스	Charles River, Berlin
RPMI	Gibco	21875-091
FBS Superior	Biochrom AG	S 0615
HEPES	Gibco-Invitrogen	15630-056
Penicillin-Streptomycin	Gibco	15140-122
L-글루타민	Gibco	25030-024
Dulbecco's PBS	Sigma Aldrich	D8662
PFA	Santa Cruz	sc-281692
Perfluoro-15-crown-5-ether	ChemPur	391-1996
Pluronic F-68	Sigma Aldrich	P5556
페트리 접시 (35 x 10 mm)	VWR, Germany	391-1996
27 ½ G 주사기	VWR, 독일	612-0151
나일론 셀 스트레이너 (100 μ m mesh)	VWR, 독일	734-0004
NMR 튜브	VWR, 독일	634-0461
EQUIPMENT
해부 도구	FST
CO2 인큐베이터	바인더
소동물 MR 시스템	Bruker Biospin		9.4T BioSpec 94/20 USR, ParaVision 획득 및 처리 소프트웨어
1H/19F 이중 조정 가능한 볼륨 RF 코일	Rapid Biomed, Wü rzburg, 독일		35 mm 내경, 50 mm 길이
19F 분광 코일	내부		튜닝/매치 루프 코일, 4회전, 내경 5 mm, 길이 10 mm, 튜닝 및 매칭
이소플루란 흡입 시스템	Fö을 위한 두 개의 커패시터; hr Medical Instruments GmbH
동물 모니터링 시스템 Model 1025	SA Instruments Inc., New York, USA