제브라 피쉬는 골격 근육의 인간의 질환을 모델링하는 새로운 시스템이다. 우리는 배아 및 유충의 제브라 피쉬에서 골격 근육의 근섬유를 분리하는 빠르고 효율적인 방법을 설명합니다. 이 방법은 하나의 골격 근육 섬유 형태의 연구에 적합한 고밀도 근섬유 준비, 단백질 세포 내 현지화, 근육 생리를 얻을 수 있습니다.
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이 논문에서
요약
초록
제브라 피쉬는 골격 근육의 기능을 탐험과 인간의 근육 질환 연구를위한 귀중한 모델 시스템으로 입증되었습니다. 특히 전체 배아, 근육 기능을 책임 복잡한 미세 구조화 단백질 환경을 시각화, 제브라 피쉬에서 골격근의 생체 내 분석에 의해 제공되는 많은 장점에도 불구하고, 문제가 될 수있다. 이 장애는 제브라 피쉬의 골격 근육 (60 μM) 및 근절의 더 작은 크기의 작은 크기에서 유래한다. 여기에 우리가 설명하고 제브라 피쉬 배아 및 유충에서 골격 근섬유를 분리하는 간단하고 빠른 방법을 보여줍니다. 우리는 또한 근육의 구조와 기능 분석을위한 유용한 게시물에 준비 기술을 설명 프로토콜 (가) 있습니다. 특히, 우리는 세부 골격 근육 단백질의 후속 면역 세포 화학 현지화 및 라이브 세포 칼슘 이미징을 통해 자극 칼슘 방출의 정성 분석. 전반적으로,이 영상기사는 제브라 피쉬의 골격 근섬유의 분리 및 특성, 근육의 구조와 기능의 수많은 후속 연구를위한 도관을 제공하는 기술에 대한 똑 바른 앞으로하고 효율적인 방법을 제공한다.
서론
골격근은 운동성 필요한 수축력 생성을 담당 고도로 전문화 된 조직이다. 수축은 세포 내 저장 1,2에서 칼슘 방출을 전기 신호로 변환 여기 수축 (EC) 커플 링으로 알려진 과정을 통해 시작됩니다. 세포 내 칼슘 릴리스는 힘을 단축하고 생성 할 수 근절을 활성화합니다. 신경 근육 접합부 전송 3, EC 커플 링 4,5, 그리고 말라 - 마이 오신 따라 수축 6 중재를 담당하는 분자 기계의 많은 특정 구성 요소는 강렬한 연구의 지속적인 대상이 될 것을 계속한다. 또한, 수축 7,8과 근섬유와 세포 외 기질 (extracellular matrix) 7,9 사이의 시그널링 중간체 동안 근육 세포막을 안정화 단백질은 확인 된 훌륭한 세부 사항에서 공부했다.
근육 구조에 중요한 유전자의 개수의 돌연변이차 기능 (인간의 골격 근육 질환의 원인으로 확인 된 http://www.musclegenetable.org/ ). 임상 및 병리 조직 학적 특징에 따라 골격 근육 병증 및 근육 이영양증으로 크게 분류 이러한 질환, 근육 약화....
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프로토콜
1. 폴리-L-라이신의 제조 코팅 Coverslips는 (시간 : 1 시간)
코팅 coverslips는 빠른 근섬유의 정착 및 접착 할 수 있습니다. 이 근섬유의 분리 (아래 단계 2)의 분리 단계에서 수행 할 수있다.
- 잘라 60mm 페트리 접시 (모든 브랜드)의 바닥에 파라 필름을 배치합니다.
- 60mm 조직 배양 접시에 파라 필름에 현미경 커버 유리 전표 (12mm 직경)를 배치 또는 24 - 웰 플레이트의 하나의 우물에 개별적으로 배치합니다.
주 1 :이 작은 원형의 coverslips는 근섬유 숫자를 집중 초과 항체의 사용을 줄일 수 있습니다.
주 2 : 다른 크기의 coverslips는 작동하지만, 사용되는 시약 및 배아의 볼륨을 적절하게 조정해야합니다.
- 피펫 페트리 접시에 각각의 커버 유리에 폴리-L-라이신 솔루션 (0.01 %)의 50 ~ 200 μL.
- 커버 슬립이 적어도 하나의 호를 앉을 수37 ° C에서 통해 UR 이상 배양 부정적인 결과에 영향을주지 않는다.
- 커버 유리로부터 폴리-L-라이신의 용액을....
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결과
근섬유의 형광 immunolabeling (그림 2)
근섬유에서 예상 형광 라벨 패턴을 보여주는 이미지는 성공적으로 분리 및 도금 후 면역 염색. 근섬유 방지 ryanodine 수용체 (1:100) (그림 2A) 또는 항-α-티닌 (1:100) (그림 2B) 항체 중 하나로 표시되어, 각각 깡패와 Z-밴드의 면역 염색을 공개하고 있습니다. 사용 된 차 항체는 알렉사 플 루어 555 (1:500)이었다. 이미지 공 초점 현미경을 사용하여 캡처.
근섬유에서 유도 칼슘 릴리스 (그림 3)
카페인 치료를 격리 근섬유의 대표 칼슘 방출을 보여주는 패널 시리즈. 간단히, 제브라 피쉬 배아는 pSKM으로 한 세포 단계에서 주입 하였다 .......
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토론
제브라 피쉬는 생체 내 25,27,28의 근육 발달과 기능 연구를위한 강력한 척추 동물 모델 시스템이다. 그들은 또한 인간의 근육 질환 14,15,20,29 모델링을위한 귀중한 자산으로 등장했습니다. 커다란 진보가 근육 기능과 근육 질환의 연구를위한 제브라 피쉬의 사용과 응용 프로그램을 사전에 촬영되었지만, 행동과 기능적인 유전, 형태 학적를, 칭찬보다 심층적 인 분석을 할 수있는 도구를 개발하는 상수 중요한 필요가있다 장점 제브라 피쉬는 이미 17을 제공합니다. 따라서 우리는 적응 해리 전체 배아에서 제브라 피쉬 근섬유의 특성에 대한 간단하고 강력한 기술을 개발했습니다.
개별 근섬유의 사용은 뮤린 모델 시스템을 이용하여 연구에서 일반적이다. 마우스에서는이 모든 동물의 실용적거나 불가능 조사 및 분석, 허용했다 inclu를딩 세포 내 단백질의 현지화 (30), 라이브 셀 이미징 .......
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공개 사항
저자는 충돌하는 이해 관계를 선언하지 않습니다.
감사의 글
저자는 기술의 개발 및 원고의 생산에 기여 다울 링 실험실의 구성원 (아론 Reifler, 트렌트 워, 안젤라 부스타, 윌리엄 Telfer)을 감사드립니다. 이 작품은 터 브먼 연구소, 미시간 대학에서 소아과와 근육질 영양 장애 협회 (JJD MDA186999)과 국립 보건원 (JJD 1K08AR054835)에서 교부금에서 일부에 의해 투자되었다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 24웰 배양 플레이트 | Corning | 3524 | |
| 10x PBS | Invitrogen Gibco | 70011 | |
| CO2 독립 배지 | Invitrogen Gibco | 18045 | |
| 콜라겐분해효소 II형 | Worthington Biochemical | LS004186 | Lot 41H12764 |
| 콜라겐분해효소 IV형 | Worthington Biochemical | L5004188 | |
| 8% 파라포름알데히드 | 전자 현미경 과학 | 157-8 | |
| 메탄올 | 시그마 | 322415 | |
| 트리톤 X-100 | 시그마 | X100 | |
| BSA | 시그마 | A2153 | |
| 양 혈청 | 시그마 | S3772 | |
| 염소 혈청 | 시그마 | G9023 | |
| 유리 커버슬립 | Fischerbrand | 12-545-82 12CIR-1D | |
| 폴리-L-라이신 | 시그마 | P4707 | |
| Pronase | 시그마 | P5147 | |
| 40 μ m 필터 | BD 생명과학 | 352340 | |
| 70 μ m Filter | BD Biosciences | 352350 | |
| Prolong Gold antifade reagent | Invitrogen | P36931 | |
| Anti-α-Actinin 항체 | Sigma | A5044 | |
| Anti-RYR 항체 | Abcam | 34C | |
| Alexa Fluor 항체 | Invitrogen | A-21425 | |
| TWEEN 20 | Sigma | P1379 | |
| 60mm 페트리 접시 | Fischerbrand | 0875713A | |
| Poly-L-Ornithine | Sigma | P4957 | |
| 현미경 슬라이드 | Fischerbrand | 12-550-15 | |
| 카페인 | 시그마 | C0750 |
참고문헌
- Dulhunty, A. F. Excitation-contraction coupling from the 1950s into the new millennium. Clin. Exp. Pharmacol. Physiol. 33, 763-772 (2006).
- Bannister, R. A. Bridging the myoplasmic gap: recent developments in skeletal....
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재인쇄 및 허가
