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방법 논문

해리 된 준비에서 배아와 애벌레 Zebrafish의 골격 근섬유의 분석

11.5K 조회수

⸱

DOI:

10.3791/50259

⸱

2013년 11월 13일

 ,  ,  ,  , 
1Departments of Pediatrics and Neurology, University of Michigan

이 논문에서

요약

제브라 피쉬는 골격 근육의 인간의 질환을 모델링하는 새로운 시스템이다. 우리는 배아 및 유충의 제브라 피쉬에서 골격 근육의 근섬유를 분리하는 빠르고 효율적인 방법을 설명합니다. 이 방법은 하나의 골격 근육 섬유 형태의 연구에 적합한 고밀도 근섬유 준비, 단백질 세포 내 현지화, 근육 생리를 얻을 수 있습니다.

초록

제브라 피쉬는 골격 근육의 기능을 탐험과 인간의 근육 질환 연구를위한 귀중한 모델 시스템으로 입증되었습니다. 특히 전체 배아, 근육 기능을 책임 복잡한 미세 구조화 단백질 환경을 시각화, 제브라 피쉬에서 골격근의 생체 내 분석에 의해 제공되는 많은 장점에도 불구하고, 문제가 될 수있다. 이 장애는 제브라 피쉬의 골격 근육 (60 μM) 및 근절의 더 작은 크기의 작은 크기에서 유래한다. 여기에 우리가 설명하고 제브라 피쉬 배아 및 유충에서 골격 근섬유를 분리하는 간단하고 빠른 방법을 보여줍니다. 우리는 또한 근육의 구조와 기능 분석을위한 유용한 게시물에 준비 기술을 설명 프로토콜 (가) 있습니다. 특히, 우리는 세부 골격 근육 단백질의 후속 면역 세포 화학 현지화 및 라이브 세포 칼슘 이미징을 통해 자극 칼슘 방출의 정성 분석. 전반적으로,이 영상기사는 제브라 피쉬의 골격 근섬유의 분리 및 특성, 근육의 구조와 기능의 수많은 후속 연구를위한 도관을 제공하는 기술에 대한 똑 바른 앞으로하고 효율적인 방법을 제공한다.

서론

골격근은 운동성 필요한 수축력 생성을 담당 고도로 전문화 된 조직이다. 수축은 세포 내 저장 1,2에서 칼슘 방출을 전기 신호로 변환 여기 수축 (EC) 커플 링으로 알려진 과정을 통해 시작됩니다. 세포 내 칼슘 릴리스는 힘을 단축하고 생성 할 수 근절을 활성화합니다. 신경 근육 접합부 전송 3, EC 커플 링 4,5, 그리고 말라 - 마이 오신 따라 수축 6 중재를 담당하는 분자 기계의 많은 특정 구성 요소는 강렬한 연구의 지속적인 대상이 될 것을 계속한다. 또한, 수축 7,8과 근섬유와 세포 외 기질 (extracellular matrix) 7,9 사이의 시그널링 중간체 동안 근육 세포막을 안정화 단백질은 확인 된 훌륭한 세부 사항에서 공부했다.

근육 구조에 중요한 유전자의 개수의 돌연변이차 기능 (인간의 골격 근육 질환의 원인으로 확인 된 http://www.musclegenetable.org/ ). 임상 및 병리 조직 학적 특징에 따라 골격 근육 병증 및 근육 이영양증으로 크게 분류 이러한 질환, 근육 약화, 평생 장애, 조기 사망의 10, 11과 연결되어 있습니다. 제브라 피쉬는 사람의 골격 근육 질환 8,12,13 모델링과 공부를위한 뛰어난 시스템으로 입증되었습니다. 그것은, 새로운 유전자 변이 8 확인 질병 병태 생리 (14, 15)의 새로운 측면을 정의하고, 새로운 치료 방법 (15, 16)를 식별하기 위해 사용되어왔다. 인간의 근육 질환 연구를위한 제브라 피쉬의 힘은 자손, 근육의 구조와 기능, 제브라 피쉬 배아의 광학 선명도 및 개발 얼룩말의 유전 적 및 약리학 적 조작의 용이성의 급속한 발전의 큰 숫자에 관한물고기 17.

우리와 다른 12,18,19 최근 개발 제브라 피쉬에서 근섬유의 신속하고 효율적인 분리를위한 간단한 기술을 개발했습니다. 이 방법론은 전체 배아 분석에 의해 제공 될 수있는 것보다 더 상세히 근섬유의 시험을 가능하게했다. 이 기술은 새로 개발 된 질병 모델 21의 검증 연구의 일환으로 중요한 병리 조직 학적 특성의 식별을위한 단백질의 세포 내 현지화 (20) 등의 특성에 악용하고있다. 또한, 고립 된 근섬유가 추가 라이브 이미징 및 전기 생리학 연구 22, 근육 기능의 주요 측면의 심문을 허용 기술을 사용할 수 있습니다. 이후의 분석 실험의 두 가지 예와 함께 근섬유 격리를위한 특정 프로토콜은이 원고의 나머지 부분에 자세히 설명되어 있습니다.

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프로토콜

1. 폴리-L-라이신의 제조 코팅 Coverslips는 (시간 : 1 시간)

코팅 coverslips는 빠른 근섬유의 정착 및 접착 할 수 있습니다. 이 근섬유의 분리 (아래 단계 2)의 분리 단계에서 수행 할 수있다.

  1. 잘라 60mm 페트리 접시 (모든 브랜드)의 바닥에 파라 필름을 배치합니다.
  2. 60mm 조직 배양 접시에 파라 필름에 현미경 커버 유리 전표 (12mm 직경)를 배치 또는 24 - 웰 플레이트의 하나의 우물에 개별적으로 배치합니다.

주 1 :이 작은 원형의 coverslips는 근섬유 숫자를 집중 초과 항체의 사용을 줄일 수 있습니다.

주 2 : 다른 크기의 coverslips는 작동하지만, 사용되는 시약 및 배아의 볼륨을 적절하게 조정해야합니다.

  1. 피펫 페트리 접시에 각각의 커버 유리에 폴리-L-라이신 솔루션 (0.01 %)의 50 ~ 200 μL.
  2. 커버 슬립이 적어도 하나의 호를 앉을 수37 ° C에서 통해 UR 이상 배양 부정적인 결과에 영향을주지 않는다.
  3. 커버 유리로부터 폴리-L-라이신의 용액을 제거하고 100 ㎕의 PBS 1X의 최소 회 씻는다.
  4. 커버 슬립이 건조하도록 허용합니다.
  5. 커버 슬립 지금 근섬유에 대한 준비가되어 있습니다.

주 3 : 불임을 보장하기 위해, 코팅은 후드 및 멸균의 coverslips에 수행 할 수 있습니다.

주 4 : 바닥에 파라 필름과 60mm 페트리 접시를 유지합니다. 이 설정은 근섬유 도금 immunolabeling (이후 단계) 동안 사용됩니다.

대안 1 : 대신 사용하기 직전에 코팅 커버 슬립으로, 코팅 coverslip에 재고가 사용할 수 있습니다. 2 ㎖ 폴리-L-라이신의 최소를 포함하는 60mm 페트리 접시는 수많은 커버 슬립을 포함하는 4 ° C에 저장할 수 있습니다. 이 대안 근섬유의 커버 슬립을 처리하는 단계 1.5에서 시작합니다.

대안 2 : 우리는 또한 폴리-L-오르니 틴의 코트 커버 슬립. 티자신의 집중보다 노동이지만, 폴리-L-오르니 틴 코팅 커버 슬립은 UV 처리 할 수​​ 있기 때문에 장기 배양하는 데 유용합니다. UV 처리 및주의 살균 기술로 라이브 근섬유는 일반적으로 4~7일 문화를 유지할 수있다.

2. 근섬유의 제브라 피쉬 배아 및 도금 (: 1 ~ 3 시간 시간)의 해리

참고 : 표준 프로토콜 3 DPF (일 포스트 수정) 배아에 가장 적용됩니다.

  1. 표준 1.5 ML의 원심 분리기 튜브에 제브라 피쉬 배아를 전송하고 가능한 한 많은 초과 물고기의 물을 제거합니다. 통상적으로, 비록 덜 튜브 당 10-20 배아가 사용될 수있다. 이상 20-25 배아를 사용하는 것은 종종 과도한 밀도 제제 초래한다.
    1. 수동 5 집게 #을 사용하여, 이전의 해리에 chorions를 제거합니다. 또한, 화학 융모막 제거는 10 ~ 15 분 프로 나제​​ 치료로 얻을 수있다. 일반적으로, 융모막의 이전 제거는 필요할 때 MUT의 사전 확인개미 표현형이나 형태가 필요합니다, 또는 단을 사용하는 경우 태아가 자연스럽게 자신의 융모막에서 부화되는 곳.
  2. 태아가 들어있는 튜브에 CO 2 독립적 인 매체 900 μl를 추가합니다.
  3. 100 콜라게나 유형 II의 μL, 최종 농도 3.125 ㎎ / ㎖ 분리를 시작합니다 (31.25 ㎎ / 1X PBS에 희석 ML의 주식 콜라게나 솔루션)를 추가합니다. 콜라게나 제 IV는 해리에 사용될 수있다.
  4. 진탕에 배아를 회전 및 분쇄를위한 P1000 Pipetman를 사용하여 실온에서 매 30 분을 씹다.

주 2 : 조심스럽게 배아 분리를 모니터링, (특히 이상) 이상 또는 해리에서 프로토콜 실패의 가장 일반적인 이유는 다음과 같습니다. 소화에 시간이 분쇄, 튜브 당 배아의 수, 배아의 연령의 강도에 따라 달라질 수 있습니다. 또한 골격 근육 돌연변이 체에서 태아에 대한 (야생 유형에 비해) 적을 수있다.

주의3 : 배아 연령 당 평균 소화 시간 = 1 시간 1 DPF, 2 DPF = 1.5 시간, 3 DPF = 2 시간, 그리고 = 2-2.5 시간 4 DPF.

  1. 더 전체 배아를 볼 수 없습니다, 그러나 고체 조각은 여전히 볼 수 있습니다 때 소화를 중지 -이 overdigestion을 방지하는 것이 필수적입니다.
  2. 펠렛 세포에 3 ~ 5 분 동안 0.8-2.3 XG에 해리 배아와 원심 분리기 튜브.
  3. 펠렛 세포 상층 액을 제거하고 CO 2 독립적 인 미디어에 배를 세척한다.
  4. 세포를 재현 탁 신선한 CO 2 독립적 인 미디어를 추가합니다. 1 ㎖는 일반적으로 10 ~ 20 배아의 최상의 상태로 준비하는 데 사용됩니다. 볼륨은 배아의 수에 따라 확장 할 수 있습니다.
  5. P1000 피펫을 사용하여, 70 μm의 필터를 통해 배아 현탁액을 전달합니다. 이 준비 원치 않는 파편을 제거하는 데 도움이됩니다.

주 4 : 배아 현탁액 더욱 원하지 않는 파편을 제거하기 위해 40 ㎛의 필터를 통해 두 번째 시간을 필터링 할 수있다. 이중 여과에서 복구 approxim이다입니다1 ㎖의 시작 볼륨에서 ately 800 μL.

  1. 각각의 폴리-L-라이신 코팅 커버 슬립에 근섬유 서스펜션의 약 50 ~ 100 μl를 추가합니다.

주 5 : 바닥에 파라 필름으로 페트리 접시의 단계 2.9를 수행 이전에 준비했다. 파라 필름이 코팅 된 커버 슬립을 실행 한 근섬유 서스펜션을 유지합니다. 증발을 방지하기 위해 덮여 페트리 접시를 유지합니다.

  1. 근섬유는 상온에서 코팅 된 커버 슬립에 약 1 시간을 해결 할 수 있습니다.

6 주 : 근섬유는 5 ~ 10 분 내에 정착하기 시작합니다. 그러나, 좋은 근섬유에 부착, 1 시간 (1-2 시간)의 최소 권장합니다. 근섬유가 오래 정착 할 수 있도록 허용하는 것은 준비를 해가되지 않습니다. (야간 등) 이상 배양 들어 항생제 매체에 첨가 할 수있다. 항생제와 살균 기술로 살아있는 문화는 일반적으로 1-2일 유지 될 수있다.

  1. 라이브 Myofibers이 시점에서 관찰 할 수있다. 배아 2 DPF에서 근섬유 나중에 가로 무늬와 신장 세포 (그림 1)로 볼 수 있습니다. 이 시점에서, 근섬유는 이제 실시간 분석을 위해 또는 immunolabeling에 대한 준비가되어 있습니다.

7 주 : 배아 DPF (1)에서 골격 근육은 가늘고 긴 명확하게 줄이있는 섬유를 도금하지 않습니다. 대신, 큰 myoballs는 볼 수 있습니다. 또, 펠렛 상 포스트 해리 중에 myoballs이 펠릿을 달성하기 위해 5000 XG에서 13 분 동안 원심 분리 최소해야 한 DPF (2.6 단계). 이 단계에서 배아의 분석을 위해, 그것은 특히 골격근 23 EGFP를 발현하는 형질 전환 라인을 사용하는 것이 좋습니다. 이것은 다른 소스에 비해 근육 원점에서 세포의 식별을 허용합니다.

3. 해리 Zebrafish의 근섬유의 형광 면역 염색 (시간 : 약 1 일)

3.1. Immunolabeling

  1. 의 일부를 제거코팅 된 커버 슬립을 준수 근섬유에서 미디어
  2. 4 % 파라 포름 알데히드 나 메탄올을 사용하여 세포를 고정합니다. PFA의 경우, 미디어의 볼륨 ½ 제거하고 PFA 같은 양으로 교체. 총 볼륨을 제거 한 후, 실온에서 10 분 동안 수정 PFA의 50 ~ 100 μL로 교체하고, 추가로 10 분 동안 고정합니다. 알코올 고정, 얼음 냉 메탄올, 아세톤의 경우 각각 10 분, 5 분 동안 4 ° C에서 적용 할 수 있습니다.
  3. 근섬유 적어도 1X PBS 또는 1X PBS로 3 배 플러스 0.1 % 트윈을 씻으십시오. 평균 세척 볼륨의 coverslip 당 50 ~ 100 μL이다.
  4. 근섬유에 대한 솔루션 (주 작업)를 차단하는 추가하고 실온에서 20 ~ 60 분을 품어. 솔루션을 차단하면 기본 및 보조 항체에 따라 달라질 수 있습니다. 실험실에서 사용되는 가장 일반적인 두 가지 (1) 1X PBS, 2 ㎎ / ㎖의 BSA, 1 % 양 혈청, 0.25 % 트리톤 X-100의 최종 및 (2) 0.2 % 트리톤 X-100, 2 ㎎ / ㎖ (아르 0.2 % BSA)과 5 %의 양 / 염소 혈청.
  5. 차단 솔루션 제거하고 B 중 하나에 희석 일차 항체를 추가용액 또는 PBS를 잠금. 4 ℃에서 하룻밤 근섬유를 품어 파라 필름 하나에 있는지 확인하거나 항체로 코팅 된 근섬유로드 커버 슬립을 포함하는 페트리 접시를 포장 사란 랩. 적신 종이 타월의 작은 조각은 가습 챔버를 만들기 위해 첨가 될 수있다.
  6. 커버 슬립에서 일차 항체를 제거하고 PBS로 5 분 또는 차단 솔루션의 coverslips에게 3 배를 세척한다.
  7. 1X PBS 또는 실온에서 1 ~ 2 시간 동안 차단 솔루션에 희석 적절한 농도 차 항체를 추가합니다.
  8. 이차 항체를 제거하고 RT에서 5 분마다 PBS에서 근섬유에게 3 배를 세척한다.

3.2. 설치의 coverslips

  1. 현미경 슬라이드에 antifade 시약을 1 ~ 2 방울을 적용합니다.
  2. 조심스럽게 픽업 코팅 및 immunolabled 커버 슬립을 현미경 슬라이드에 antifade 시약에 커버 슬립을 (근섬유를) 핀셋과 장소를 사용하여.

C의 방향에주의 : 주 1oated 커버 슬립이 중요합니다.

  1. 하드 고체 표면에 1-2 킴 와이프를 놓습니다. 신속 antifade 시약에 휴식 코팅 된 커버 슬립과 슬라이드를 거꾸로 킴 와이프에 (아래 coverslip에) 배치합니다.
  2. 초과 antifade를 제거하고 슬라이드 및 coverslip에 단단히 밀착을 형성하기 위해 현미경 슬라이드의 모서리에 약간의 힘을 주어
  3. 실온에서 5 ~ 10 분 동안 건조 남아있는 antifade는 다음 근섬유는 4 ℃에서 (그림 2A와 B) 또는 상점 이미지 준비가 허용

4. GCaMP3을 사용하여 라이브 세포 칼슘 이미징

라이브 세포 실험 (단계 2.10 다음) 이전에 고정으로 근섬유에서 수행 할 수 있습니다. 다음 프로토콜은 GCaMP3 24, 골격근 특정 제브라 피쉬의 α-액틴 프로모터 (pSKM) (23)에 의해 표현 된 유전자 인코딩 칼슘 지표를 표현하는 근섬유의 라이브 영상에 대해 설명합니다. 또한,이러한 기술은 용이 등의 Fura-2와 같은 칼슘 인디케이터 염료를 사용하도록 구성 될 수있다.

  1. pSKM으로 배아를 주입 : GCaMP3은 1-2 세포 단계에서 구성
  2. 3 DPF에서 애벌레를 수집하고 섹션 1과 2에 설명 된대로 근섬유를 준비합니다. 근섬유는 1 시간의 최소 준수 할 수 있습니다. 이 기술의 경우, 24 잘 접시에 준비 커버 슬립이 필요합니다.
  3. 조심스럽게 초과 용지를 제거하고 실온에서 신선한 CO 2 독립적 인 미디어의 300 μl를 추가합니다.
  4. 거꾸로 현미경으로 세포를 관찰합니다. GCaMP3 긍정적 인 근섬유는 녹색 형광에서 볼 수 있어야합니다.
  5. 원하는 경우, 녹화 카메라를 설정합니다.
  6. CO 2 독립적 인 미디어에 30 mM의 카페인 솔루션을 준비합니다. 세포를 자극하기 위해, 부드럽게 확대에 따라 우물에 카​​페인 용액 300 μl를 피펫. 5 ~ 10 초 이내, GCaMP 긍정적 인 근섬유는 형광의 급격한 증가 (그림 3)과 카페인에 응답해야합니다. MyofibERS는 계약을 체결 할 수 있습니다. 참고로, 카페인이 근질 세망 저장 25에서 칼슘 방출을 유도한다. 등의 KCl 26 ryanodine 4와 같은 다른 에이전트, 유도 칼슘 방출을 연구하는 데 사용할 수 있습니다.

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결과

근섬유의 형광 immunolabeling (그림 2)

근섬유에서 예상 형광 라벨 패턴을 보여주는 이미지는 성공적으로 분리 및 도금 후 면역 염색. 근섬유 방지 ryanodine 수용체 (1:100) (그림 2A) 또는 항-α-티닌 (1:100) (그림 2B) 항체 중 하나로 표시되어, 각각 깡패와 Z-밴드의 면역 염색을 공개하고 있습니다. 사용 된 차 항체는 알렉사 플 루어 555 (1:500)이었다. 이미지 공 초점 현미경을 사용하여 캡처.

근섬유에서 유도 칼슘 릴리스 (그림 3)

카페인 치료를 격리 근섬유의 대표 칼슘 방출을 보여주는 패널 시리즈. 간단히, 제브라 피쉬 배아는 pSKM으로 한 세포 단계에서 주입 하였다 ...

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토론

제브라 피쉬는 생체 내 25,27,28의 근육 발달과 기능 연구를위한 강력한 척추 동물 모델 시스템이다. 그들은 또한 인간의 근육 질환 14,15,20,29 모델링을위한 귀중한 자산으로 등장했습니다. 커다란 진보가 근육 기능과 근육 질환의 연구를위한 제브라 피쉬의 사용과 응용 프로그램을 사전에 촬​​영되었지만, 행동과 기능적인 유전, 형태 학적를, 칭찬보다 심층적 인 분석을 할 수있는 도구를 개발하는 상수 중요한 필요가있다 장점 제브라 피쉬는 이미 17을 제공합니다. 따라서 우리는 적응 해리 전체 배아에서 제브라 피쉬 근섬유의 특성에 대한 간단하고 강력한 기술을 개발했습니다.

개별 근섬유의 사용은 뮤린 모델 시스템을 이용하여 연구에서 일반적이다. 마우스에서는이 모든 동물의 실용적거나 불가능 조사 및 분석, 허용했다 inclu를딩 세포 내 단백질의 현지화 (30), 라이브 셀 이미징 ...

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공개 사항

저자는 충돌하는 이해 관계를 선언하지 않습니다.

감사의 글

저자는 기술의 개발 및 원고의 생산에 기여 다울 링 실험실의 구성원 (아론 Reifler, 트렌트 워, 안젤라 부스타, 윌리엄 Telfer)을 감사드립니다. 이 작품은 터 브먼 연구소, 미시간 대학에서 소아과와 근육질 영양 장애 협회 (JJD MDA186999)과 국립 보건원 (JJD 1K08AR054835)에서 교부금에서 일부에 의해 투자되었다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
24웰 배양 플레이트Corning3524
10x PBSInvitrogen Gibco70011
CO2 독립 배지Invitrogen Gibco18045
콜라겐분해효소 II형Worthington BiochemicalLS004186Lot 41H12764
콜라겐분해효소 IV형Worthington BiochemicalL5004188
8% 파라포름알데히드전자 현미경 과학157-8
메탄올시그마322415
트리톤 X-100시그마X100
BSA시그마A2153
양 혈청시그마S3772
염소 혈청시그마G9023
유리 커버슬립Fischerbrand12-545-82 12CIR-1D
폴리-L-라이신시그마P4707
Pronase시그마P5147
40 μ m 필터BD 생명과학352340
70 μ m FilterBD Biosciences352350
Prolong Gold antifade reagentInvitrogenP36931
Anti-α-Actinin 항체SigmaA5044
Anti-RYR 항체Abcam34C
Alexa Fluor 항체InvitrogenA-21425
TWEEN 20SigmaP1379
60mm 페트리 접시Fischerbrand0875713A
Poly-L-OrnithineSigmaP4957
현미경 슬라이드Fischerbrand12-550-15
카페인시그마C0750

참고문헌

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해리 된 준비에서 배아와 애벌레 Zebrafish의 골격 근섬유의 분석
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