Hippocampal 슬라이스 문화의 시냅틱 단백질의 포스트 퍼가기 Immunogold 라벨링

요약

단백질의 지역화 및 배포는 세포 기능을 이해하기위한 중요한 정보를 제공합니다. 전자 현미경의 우수한 공간 해상도 (EM)는 주어진 항원에 따라 immunohistochemistry의 subcellular 지방화를 결정하는 데 사용할 수 있습니다. 유지 항원은 EM 연구에 특히 곤란했던 반면 구조적 무결성을 유지 중추 신경계 (CNS)의 조직하십시오. 여기, 우리는 공부를 할 수있는 CNS에 구조와 항원을 보존하고 쥐 hippocampal CA1 피라미드 뉴런에서 시냅스 단백질을 특성화하는 데 사용 된 절차를 채택한다.

초록

Immunoelectron 현미경은 subcellular 수준에서 생물 분자를 연구 할 수있는 강력한 도구입니다. 이러한 콜로이드 금과 같은 전자 - 고밀도 마커에 연결된 항체가 다양한 조직 ¹ 특정 항원의 지역화 및 배포를 공개 할 수 있습니다. 두 가장 널리 사용되는 기법은 사전 삽입 및 사후 삽입 기술이다. 사전 퍼가기 immunogold - 전자 현미경 (EM) 기술에서, 조직은이 내장되기 전에 항체 침투를 허용하도록 permeabilized해야합니다. 이 기술은 구조이지만 항체의 가난한 침투는 (보통은 처음 몇 ㎛) 상당한 단점 ^2를 보존 이상적입니다. 항원이 더 쉽게 접근 할 수있는 곳 라벨이 고정 조직의 섹션에서 진행하기 때문에 사후 퍼가기 라벨 방법이 문제를 피할 수 있습니다. 지난 몇 년 동안, 수정 번호 immunoreactivity을 강화하고 ultrastructure을 유지하기 후 삽입 방법을 향상 조직 고정은 EM 연구의 중요한 부분입니다. Fixatives는 화학적 곳에서 조직 구조를 잠글 고분자를 crosslink. 정착액의 선택은 구조 보존뿐만 아니라 항원 및 대비뿐만 아니라 영향을 미칩니다. 오스뮴의 tetroxide (OSO _4), 포름 알데히드, 그리고 글 루타 알데히드는 중추 신경계 (CNS) 화학 및 물리적 처리 중 구조적인 손상에 특히 경향이 조직에 포함 수십 년 동안 표준 fixatives했습니다. 불행하게도, OSO ₄ 반응성이 매우 높은이며, 가난하고 부족한 라벨의 결과로, 항원에게 ⁶ 숨길 수 표시되었습니다. 화학 고정을 피하기 위해 다른 접근 방법은 조직을 동결 있습니다. 하지만이 기술은 고가의 계측을 수행하고 필요로하기가 어렵습니다. 이러한 문제 중 일부를 해결하려면 및 CNS의 조직 라벨, Phend 외를 향상시킬 수 있도록 지원합니다. uranyl 아세트산 (UA)과 타닌 성의 ACI와 OSO ₄ 교체D (TA), 그리고 성공적으로 항원 검출 및 뇌 및 척수의 조직 ⁷ 구조 보존의 감도를 향상시키기 위해 추가 수정을 소개했다. 우리는 쥐의 뇌 조직이 오스뮴 무료 후 퍼가기 방법을 채택하고 신경 단백질을 감지하고 공부하기 immunogold 라벨 기술을 최적화했습니다.

우리는 여기서 쥐 hippocampal CA1 피라미드 뉴런의 시냅스 단백질의 ultrastructural 현지화를 결정하는 방법을 제시한다. 우리는 organotypic hippocampal 조각 양식을 사용합니다. 이 조각은 해마의 trisynaptic 회로를 유지하고, 따라서이 신경 소성을 공부에 특히 유용합니다, 메커니즘이 널리 학습과 기억을 기초 생각. 출생 후의 일 5와 6 마우스 / 쥐 새끼에서 Organotypic hippocampal 슬라이스는 이전에 ^8에 설명 된대로 준비하고, 심하게 분해 또는 overexpress 외인성 단백질에 특히 유용합니다 수 있습니다. 우리는 이전에 채널이 프로토콜을 사용했습니다neurogranin (잉), 신경 기능 할 ^8,9을 조절에 중요한 역할이있는 뉴런 특정 단백질을 aracterize. 우리는 또한 calmodulin (CAM) 및 CA ^{2 +} / CAM에 의존 단백질 키나제 II (CaMKII) ^10의 ultrastructural 현지화를 특징하는 데 사용했습니다. 결과에 도시 된 바와 같이,이 프로토콜은 수지상 쪽과 척추 ^8의 분포를 특성화하는 데 도움이 잉 효율적으로 라벨을 잘 ultrastructural 보존 할 수 있습니다. 또한, 여기에 설명 된 절차는 neuronal 기능에 관여 다른 많은 단백질을 연구에 다양한 응용을 할 수 있습니다.

프로토콜

1. 정착

Fixatives는 발암 성이다; 장갑을 착용하고 연기 후드에 fixatives를 처리합니다. 별도로 명시하지 않는 한, 모든 incubations은 얼음에 완료하고 모든 솔루션은 사용하기 전에 필터링해야합니다. 전자 현미경 수준의 시약을 사용합니다.

1 일

1. 실험 조건 후 (예 : 바이러스 주입, 약물 치료)에 organotypic hippocampal 슬라이스로 막 배치 60 X 얼음처럼 차가운 0.1 M 인산 버퍼 (소렌슨의 인산 완충), pH를 7.3를 포함하는 15mm의 폴리스티렌 페트리 접시. 1 추가 - 직접 조각 위에 0.1 M 인산 버퍼 2 ML 그들에게 차가운 유지할 수 있습니다.

임계 단계 : 항상 신선하게 조리 된 버퍼와 fixatives을 사용합니다. 버퍼의 pH가 원하는 범위 내에 있는지 확인하십시오. 그렇게 할 실패 세포 구조를 손상 수 있습니다.

2. 슬라이스의 CA1의 subfield를 분리하려면,를 사용하여부드럽게 CA1 세포 레이어 (그림 1)에 평행 DG 옆에있는 슬라이스에 걸쳐자를 일회용 메스. 그런 다음 세로로 CA3 subfield과 subiculum를 제거하는 나머지 조각을 잘라. 조직의 상단 표면을 식별하는 데 도움이 슬라이스의 모서리를 잘라.

참고 : 관심 단백질의 어떤 바이러스 전달이 필요하지 않습니다 경우에는 미디어가 얼음처럼 차가운 버퍼 씻어 부드러운로 제거 된 후, 전체 조직 슬라이스가 해결 될 수 있습니다. 이것은 다음 CA1을 절단을합니다.

임계 단계 : 나중에 격자의 적절한 sectioning 수 있도록 조직의 갑판을 확인합니다.

3. 조심스럽게 메스의 뒷면을 사용하여 막에서 조직을 제거합니다. 부드럽게 0.1 M 인산 버퍼를 포함하는 12 잘 판에 조직을 전송하는 파스퇴르 피펫을 사용합니다.
4. 접시에서 잘에있는 버퍼를 제거하고 추가 500 & mU; 난 - 1 다음으로 구성 얼음처럼 차가운 정착액의 ML (산도 7.3) : 0.1 % 피크르산, 1 % paraformaldehyde와 0.1 M 인산 버퍼에 2.5 %의 글 루타 알데히드. 4에서 2 시간에 품다 ° C.

참고 : 피크르산 때 건조 폭발 할 수 있습니다. 가 단단히 닫혀 용기에 물과 침수하세요. 건조하고 환기가 잘되는 장소에 보관하십시오.

5. 우물에서 정착액을 제거하고 0.1 M 인산 버퍼에 샘플 3 회 (20 분마다)을 씻는다.
6. 0.1 M의 maleate 버퍼, 산도 6.0의 1퍼센트 타닌산 (w / V)에서 40 분에 품다.
7. maleate 버퍼에 (20 분마다) 두 번 씻어.
8. 어둠 속에서 maleate 버퍼의 1 % uranyl 아세트산 (w / V)에서 40 분에 품다. Uranyl 아세테이트은 빛에 민감하고 방사성 있습니다. 용해시 Parafilm로 비커를 커버와 4 ° C.에 어둠 속에서 사용되지 않는 버퍼를 저장
9. maleate 버퍼에 (20 분마다) 두 번 씻어.
10. 0.5 % 플래티넘 chlor에 20 분에 품다maleate 버퍼의 IDE (w / V).
11. maleate 버퍼에 (20 분마다) 두 번 씻어. 4에서 샘플을 저장 ° C가 더 처리를위한 준비가 될 때까지.

2. 탈수 및 삽입

프로필렌 산화물은 발암 있습니다. 연기 후드에 작업하여 증기를 사용하지 마십시오. 물의 흔적을 포함하지 절대, 100 % 순수 에탄올을 사용합니다. 탈수에 대해 서로 다른 농도를 생성하기 위해이 절대 에탄올을 희석.

2 일

1. 50 % 에탄올 5 분 동안 배양 한 후 70 % 에탄올 5 분에.
2. 70 % 에탄올에서 신선하게 조리 된 1퍼센트 P-phenylenediamine (PPD)에서 15 분에 품다.
3. 70 % 에탄올에 세 번 씻어.
4. 80 % 에탄올 5 분 동안하고 95 % 에탄올 5 분에 품다.
5. 100 % 에탄올에 두 번 5 분 각각 품다.
6. 나사 모자와 유리 병을 준비하고 깨끗하고 완전히 건조되었는지 확인하십시오. 유리 병에 조각을 전송하고간단하고 명확하게 각 유리 병에 라벨.
7. 프로필렌 산화물 : 1시 1분 에탄올에 5 분에 품다.
8. 100 % 프로필렌 산화물에 두 번 5 분 각각 품다.
9. 프로필렌 산화물과 1:1 혼합물을 각 유리 병에 수지 (Epon)를 추가합니다. 부드럽게 2 시간에 섞는다. 퍼가기에 영향을 줄 수 있습니다 거품을 방지하기 위해 너무 엄격하게 병을 흔들지 마세요.
10. 프로필렌 산화물, 그리고 2 시간에 혼합 3시 1분 혼합물을 만들기 위해 수지를 추가합니다.
11. 100 % 수지로 갈아 품다 O / N.

3 일

12. 60 ACLAR 플라스틱 및 2​​4 시간에 대한 치료의 스트립 사이에 샌드위치 샘플 ° C.

3. Sectioning 및 격자에 장착

4 일

1. 준 얇은 (0.5 μm) 부분을 잘라 1% toluidine 블루 + 샘플의 정확한 방향을 결정하는 1 %의 붕사와 얼룩.
2. ultrathin 섹션 (60 나노 미터)를 잘라 니켈 격자, 격자 당 하나의 섹션에 탑재합니다.

4. Immunohistochemistry

모든 버퍼와 물은 사용하기 전에 필터링해야합니다.

5 일

1. 평평한 표면에 깨끗한 Parafilm의 한 부분에 1 % Tween-20/phosphate 버퍼 (T / PB), 산도 7.5, 한 방울 (~ 50 μl)를 배치합니다. 부드럽게 가장자리가 깨끗한 포셉으로 격자을 선택하고 버퍼 섹션 아래, 그리고 RT 10 분에 품다에 떠.
2. 종이를 필터링 섹션에면을 배치하여 격자에서 초과 액체를 배출 한 후 RT 15 분 동안 T / PB 50 MM 글리신을 떠.

임계 단계 : 피하려면 과도한 '연행를 통해'한 솔루션 비말에서 incubations 동안 다음에 대한 해결 방법, 부드럽게 각 솔루션의 변화 사이의 # 1 거름 종이에 격자의 가장자리를 터치하여 초과 액체를 배수한다. 또한 EM의 팔 사이에 갇혀있는 솔루션을 제거 부드럽게 포셉의 팔 사이에 필터 종이 조각을 wicking하여 그리드를 잡고 집게 동안 ensu섹션 완전히 건조하지 않습니다 반지.

3. 거름 종이로 격자를 건조하고 RT에서 30 분을위한 T / PB의 보조 항체의 동물에서 2.5 % BSA와 2.5 %의 혈청을 포함하는 솔루션을 차단에 떠.
4. 4 ° C.에서 RT 또는 O / N에서 기본 항체 (T / PB에)에 품다 최적의 시간과 온도 부화의뿐만 아니라 항체 농도는 실험적으로 결정해야합니다.
5. 그리드에게 T / PB와 세 번 (2 분 각각)를 씻으십시오.
6. RT에서 1 시간에 차 항체 (10 나노 미터의 금으로 커플 링 1시 20분 백신 토끼 또는 안티 마우스)에 품다.
7. T / PB와 세 번 (2 분 각각)를 씻으십시오.
8. 5 분을위한 T / PB의 2 % 글 루타 알데히드와 접미사.
9. 그런 다음 T / PB 세 배 (2 분 각) 필터링 물을 세 번 (2 분 각각)를 씻으십시오.
10. 10 분 물에 2 % uranyl 아세트산을 품다.

그리드는 얼룩하는 동안 placin하여 CO ₂ 무료 챔버를 준비유리 페트리 접시의 중앙에 Parafilm의 GA 기사. 그런 다음 공중에 CO _2를 흡수 할 수 Parafilm 주변의 접시에 NaOH의 4-6 알약을 넣습니다. 몇 분 동안 상단을 감고. 파스퇴르 피펫을 사용하여 신속하게 유리 배양 접시에 Parafilm에 대한 레이놀즈 리드 구연산 솔루션의 작은 볼륨을 전송할 수 있습니다. 챔버에 CO _2의 재 도입을 최소화하기 위해 파스퇴르 피펫를 삽입 할 충분한 상단을 엽니 다.

참고 : 레이놀즈 리드 구연산 솔루션을 만들려면, 전자 렌지에 탈 이온수 100 ML을 끓여야하고 밀폐 용기에 시원한 보자. 스토퍼로 50 ML 용적 플라스크에 혼합 1.33 g 리드 질산염, 1 분 동안 힘차게 흔들어하여 1.76 g 나트륨 구연산과 삶은 물 30 ML. 그런 다음 30 분에 간헐적으로 흔들림. 이 흐린 솔루션으로, 1 M의 수산화 나트륨 8 ML을 추가하고 천천히 플라스크에게 몇 번 반전. 솔루션 명백해질 것이다. 삶은 구미시와 함께 50 ML에 대한 해결책을 가져적이. 단단히 봉인 솔루션을 저장합니다. 침전물가 나타나면 취소하고 새로운 하나를합니다.

11. 에 세 작은 비커은 따뜻한 갓 삶은 탈 이온수를 준비합니다. 첫 번째 비커에 격자를 찍어 30 초 주위에 부드럽게 소용돌이를하여 uranyl 아세트산을 씻으십시오. 다른 두 비커에서이 단계를 반복합니다.
12. 레이놀즈 리드 구연산 솔루션의 드롭 격자를 배치 할 충분한 유리 페트리 접시의 상단을 엽니 다. 가능하면 리드 구연산에서 호흡을 방지하고 석출물의 형성을 방지하기 위해이 일을하는 동안 마스크를 착용하십시오. 10 분에 품다.
13. 그리드를 제거 할 충분한 상단을 엽니 다. 리드 구연산 호흡을하지 마십시오. 따뜻하고 신선한 삶은 증류수는 3 비커에 순​​차적으로를 찍어하여 그리드 세 번 씻으십시오. 필터 종이, 절까지의 부분에 격자가 건조 보자. 샘플은 현재 전자 현미경을위한 준비가되었습니다.

결과

그림 2B는 CA1 hippocampal 피라미드 뉴런의 수지상 쪽의 내생 잉 분자의 분포의 예를 보여줍니다. 해마의 CA1 영역을 (그림 2A에서 본)이 포함 된 ultrathin (60 나노 미터) 조직과 니켈 격자은 1 %에 덮여 된 후 반으로 부화하기 전에 2.5 % BSA와 혈청 2.5 %로 차단 T / PB, 50 MM 글리신, - 잉 항체. T / PB와 함께 세탁하면, 격자는 이후 10 나노 미터의 금으로 커플 링 방지 토끼 차 항체로 덮여 있었다. 마지막으로, 격자는 T / PB와 세척 및 2 % uranyl 아세테이트와 대비를 강화하기 위해 얼룩 레이놀즈 리드 구연산에 이어 2 % 글 루타 알데히드와 postfixed되었습니다. 비대칭 시냅스를 보여주는 왼쪽, 대표 전자 micrographs이 있습니다. postsynaptic 구획의 식별은 전자 집적 PSD (화살표 머리)와 잘 정의 된 플라즈마 막에 의해 촉진되는 것은. 맞...

토론

이 프로토콜에서는, 우리는 쥐 hippocampal 슬라이스 문화의 수지상 쪽을 연구하는 뇌와 척추의 조직에 대한 Phend와 와인버그 방법을 채택했다. hippocampal CA3-CA1 지역의 수지상 쪽은 neuronal 기능을 조절에 중요​​한 역할을 단백질의 광대 한 다양한을 포함하는 섬세한 구조입니다. 제시 방법은 적절한 라벨 효율성과 척추 내 특정 항원의 분포를 특성화하는 데 유용합니다 좋은 재현성을 허용, 좋은 ultrastructural 보존 (그림 2A)을 유지하면서 향상된 항원을 달성하기위한 균형 잡힌 접근 방식을 제공합니다. 여기, 우리는 10 나노 콜로이드 금으로 응 표시. 우리는 시냅스 기능 (그림 2B) ⁸ 년에 역할을 이해하는 데 도움 잉의 라벨 패턴을 생성하기 위해 금을 정량화.

immunogold의 정량 분석 방법 ^11-13의 다양한 수행 할 수 ...

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
60 x 15 mm 폴리스티렌 페트리 접시	Falcon	351007
일회용 메스	EXELINT	29552
세포 배양 인서트	Millipore	PICM03050
10 nm 염소 - 안티 토끼 골드	전자 현미경 과학	25108
안티 뉴로 그라닌 항체	Millipore	AB5620
100% 피크르산	전자 현미경 과학	19550
96% 파라포름알데히드	아크로스 유기물	AC41678-0030
25% 글루타르알데히드(EM 등급)	Sigma	G5882
우라닐 아세테이트	전자 현미경 과학	22400
p-페닐렌디아민	시그마	P6001
플래티넘(IV) 클로라이드	Sigma	379840
탄닌산	전자 현미경 과학	21710