방법 논문

집에서 만든 듀얼 글로우 루시 페라 제 분석 실험을 사용하여 높은 처리량 기능 검사

DOI:

10.3791/50282

⸱

2014년 6월 1일

 , 
1Department of Neurology, Massachusetts General Hospital

이 논문에서

요약

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우리는 높은 처리량 로봇 형질과 집에서 만든 듀얼 글로우 루시 페라 제 분석을 사용하여 전사 규제를 식별하기위한 신속하고 저렴한 검사 방법을 제시한다. 이 프로토콜은 빠른 속도로 유전자의 수천을 위해 직접 나란히 기능 데이터를 생성하고, 관심의 유전자를 대상으로 쉽게 변경 가능합니다.

초록

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우리는 α-시누 클레인 파킨슨 질환과 관련된 유전자의 전사 레귤레이터를 식별하기 위해 신속하고 저렴하게 높은 처리량 선별 프로토콜을 제시한다. 293T 세포는 일시적으로 한 유전자 당 잘 마이크로 포맷, 함께 루시퍼 라제 리포터 플라스미드로, 배열 ORF 식 라이브러리에서 플라스미드로 형질됩니다. 반딧불 루시 페라 제 활동은 내부 통제 구조 (레 닐라 루시퍼를 연출 HCMV 프로모터)의 표현에 표준화 된 알파 synuclein의 전사,시 각 라이브러리 유전자의 효과를 결정하기 위해 48 시간 후 정량된다. 이 프로토콜은 96 - 웰 형식으로 무균 액체 처리를 수행하는 생물 안전 캐비닛에 동봉 된 벤치 탑 로봇에 의해 촉진된다. 우리의 자동화 된 형질 전환 프로토콜은 높은 처리량 렌티 바이러스 라이브러리 생산 conju 고유 라이브러리 플라스미드 많은 수의 트리플 형질을 필요로하는 다른 기능 검사 프로토콜에 쉽게 적응할 수있다도우미 플라스미드의 일반적인 세​​트 nction. 우리는 또한 저렴하고 검증 된 대안을 제시 PTC124, EDTA, 사전 레 닐라 루시퍼의 측정에 반딧불 루시 페라 제의 활동을 억제하는 피로 인산을 사용 시판, 이중 루시퍼 라제 시약을합니다. 이러한 방법을 사용하여, 우리는 7,670 인간의 유전자를 검사 및 알파 synuclein의 68 레귤레이터을 확인했다. 이 프로토콜은 관심의 다른 유전자를 대상으로 쉽게 변경 가능합니다.

서론

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키 유전자 규제 요소와 그들에 작용하는 요소를 식별 할 수있는 능력은 다양한 생물학적 과정의 탐사를 위해 필수적입니다. 그러나, 특정 신경 세포의 집단으로 희귀 한 종류의 세포에서 유전자의 발현을 조절 요소를 식별, 도전하실 수 있습니다. 여기서, 우리는 α-시누 클레인 (SNCA)의 신규 한 전사 레귤레이터를 식별하기위한 프로토콜을 제시, 파킨슨 질환과 연관 substantianigra에서 도파민 뉴런에서 발현 유전자의 중뇌 compacta 영역 모양체. 우리는 293T 세포에서 α-시누 클레인의 발현을 재조하기 위해 높은 처리량, 이중 - 루시퍼 라제, 시험 관내 리포터 스크린을 사용하여이를 달성. 알파 synuclein 촉진제 우선 개똥 벌레 루시퍼 라제 유전자를 포함하는 리포터 플라스미드로 클로닝된다. 구성 적으로 활성화 된 프로모터의 조절하에 레 닐라 루시퍼 라제를 함유하는 시판되는 플라스미드는 내부 제어로서 기능한다. 살전E 기자의 구조는 각이 잘 단일 라이브러리 플라스미드로 형질되도록, DNA 발현 라이브러리에서 플라스미드와 마이크로 플레이트에 293T 세포에 공동 형질 전환됩니다. 48 시간, 각 리포터 대해 루시퍼 라제 활성을 듀얼 글로우 분석을 사용하여 순차적으로 측정 한 결과. 플레이트 기반 정상화 : (R 비율 F) 각 잘 레 닐....

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프로토콜

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실험 개요는 그림 1을 참조하십시오.

1. 알파 synuclein 발기인을 포함하는 리포터 플라스미드를 준비

알파 synuclein 유전자 (그림 2)의 규정 요소는 인트론 2 ~ 3 상류 NACP (아밀로이드 펩티드의 비 베타 구성 요소) 디 뉴클레오티드 반복 서열 1,2에서 대략 10 킬로바이트, 스팬. 우리는이 지역의 일부를 포함 우리 기자의 구조. 우리는 성장이 필요한 특별한 절차 인트론 포함하는 플라스미드는, 아래에 설명 된대로 나타났습니다. 루시퍼 라제 플라스미드, pGL4.10 및 pGL4.75 (도 3), Promega 사에서 시판하고 종래의 분자 생물학 프로토콜을 사용하여 전달 될 ​​수있다.

  1. 표 1의 제조법과 표 2의 프라이머를 사용한 PCR을 별도의 알파 synuclein 촉진제의 2 성분을 증폭한다.
  2. VERI기 PCR의 TE (트리스-EDTA)의 50 μL의 용출, 제품, QIAquick PCR 정제 키트 (Qiagen)를 사용하여 아가 로스....

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결과

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일반 루시퍼 값, F : R의 비율과 하나의 하프 플레이트 유도 값을 그림 4에 나타내었다 아니라 H2, 32 배 유도에 타격을합니다.. 과도한 독성 (예를 들어, 잘 E3), 또는 가난하게 형질 전환 된 우물을 일으키는 유전자는 모두 개똥 벌레와 레 닐라 luciferases 낮은 값을 생성하지만, 평균 유도 값이됩니다. pGL4 백본과의 상호 작용을 통해, 아마도 루시퍼 라제 활성의 비특이적 유도를 일으키는 유전자는 보통 유도 값의 결과와 동등 반디 레 닐라 luciferases 유도 할 것이다. 반복 실험 사이의 유도 값에 큰 차이는 실행 오류에 대한 의혹을 제기해야합니다. 그것은 발현이 증가의 원인이 클론이 증가 루시 페라 제 활동으로 측정 할 수 있도록 화면이 기자의 분석의 선형 범위 내에서 수행되고 있는지 확인하는 것이 중요합니다. 우리는 선형성을 검증하기 위해 각 리포터 유전자의 양이 증가 형질우리의 실험 조건에서 기자 분석의

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토론

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알파 - 시누 클레인은 루이 기관 4, 질병에 대한 pathognomonic 고려 세포 흠의 구성 요소로 파킨슨 병 (PD)에 연루되어있다. 수많은 게놈 넓은 협회 연구는 산발적 PD 5,6,7에 대한 위험 증가와 알파 synuclein의 단일 염기 다형성을 연결했다. 산발적 PD보다 일반적인 있지만, 가족 PD는 또한뿐만 아니라 복제 및 α-synuclein의 궤적 9,10,11의 삼배로, 알파 synuclein 8 돌연변이에 의해 발생할 수 있습니다, 현상은 산발적 PD (12)의 본. 이와 함께,이 연구는 PD의 병인에 알파 synuclein의 중심성을 강화. 이 화면의 목적은 α-시누 클레인 조절 유전자를 확인하고, 따라서 파킨슨 병의 병인에서 역할을 할 수 있었다. 이 프로토콜을 사용하여, 우리는 7,670 인간의 유전자를 선별하고 140을 대표하는, 154 예비 안타 (이상 유도를 3 배) 확인고유 한 유전자. 이러한 .......

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공개 사항

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이 작품은 라이선스 BacMamreagents (미국 특허 5,731,182)에 의해 얻어진 로열티에 의해 지원되었다.

감사의 글

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우리는 DNA 검사 라이브러리의 준비를 위해 MGH DNA 코어의 존 Darga 감사합니다. 퍼킨 엘머의 크리스토퍼 Chigas 우리 월락 1420 루미 매우 귀중한 지원을 제공했습니다. 스티븐 Ciacco 및 애질런트의 마틴 Thomae은 브라보 로봇에 대한 지원을 제공했다. 우리는 아낌없이 자신의 이중 글로 루시 페라 제 분석 프로토콜을 제공하기위한 NIH에 론 존슨 (Ron Johnson)과 스티브 디도 감사합니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
Material
QIAQuick PCR 정제 키트Qiagen28106
PureLink 퀵 젤 추출 키트InvitrogenK2100-12
PureLink PCR 마이크로 키트InvitrogenK310250
PureLinkHiPure 플라스미드 Miniprep KitInvitrogenK2100-03
PureLinkHiPure 플라스미드 Maxiprep 키트InvitrogenK2100-07
Bravo RobotAgilent-Robot
Pipet 팁(필터 포함) Agilent19477-022
로봇 피펫 팁(필터 미포함) Agilent19477-002
투명 바닥 96웰 플레이트Corning3610
ReservoirsAxygenRES-SW96-HP-SI
폴리스티렌 V-바닥 96-웰 플레이트Greiner651101
폴리프로필렌 V-바닥 96-웰 플레이트Greiner651201
접착 플레이트 커버CryoStuff#FS100
Reagent
Phusion DNA PolymeraseNew England BiolabsM0530L
BAC 2002-D6Invitrogen2002-D6
송아지 장 알칼리성 포스파타제Roche10713023001
T4 DNA 리가제New England BiolabsM0202L
pGL4.10PromegaE6651
pGL4.74PromegaE6931
ElectroMAX Stbl4 역량 세포Invitrogen11635-018
서브클로닝 효율 DH5α 유능한 세포Invitrogen18265-017
페놀 없는 DMEM 레드Invitrogen31053-028
OptifectInvitrogen12579017
CiprofloxacinCellGro61-277-RF
Tris-Hydrochloride 분말Sigma93287
Tris-Base 분말 Sigma93286
Triton X-100 순수 액체FisherBP151-100
DTTInvitrogen15508-013
C– nzyme ANanolight309
ATPSigmaA6419
LuciferinInvitrogenL2912
h-CTZNanolight301
PTC124SelleckBiochemicalsS6003

참고문헌

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Chiba-Falek, O., Nussbaum, R. L. Effect of allelic variation at the NACP-Rep1 repeat upstream of the α-synuclein gene (SNCA) on transcription in a cell culture luciferase reporter system. Hum. Mol. Genet. 10 (26), 3101-3109 (2001).
  2. Chiba-Falek, O., Touchman, J. W., Nussbaum, R. L.

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재인쇄 및 허가

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태그

ORF293T

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