방법 논문

Microcontact 인쇄를 통해 정렬 기능 심근 조직의 생성

DOI:

10.3791/50288

⸱

2013년 3월 19일

 , 
1Cardiovascular Research Center, Massachusetts General Hospital and Harvard Medical School, 2Harvard Stem Cell Institute

이 논문에서

요약

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

정렬 심근 조직의 생성 임상 유용한 목적에 줄기 세포 생물학의 최근 발전을 조절하기위한 중요한 요구 사항입니다. 여기에 우리는 세포의 형태와 기능의 정확한 제어를위한 microcontact 인쇄 방법을 설명합니다. 심장 progenitors을 파생 배아 줄기 세포의 높은 정화 인구 사용하여, 우리는 비 등방성 기능 심근 조직을 생성합니다.

초록

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고급 심장 마비가 가능한 및 / 또는 모든 기능 심장 근육 세포의 손실로 인해 발생하는, 주요 부족한 임상 도전을 나타냅니다. 최적의 약물 치료에도 불구하고, 심장 마비는 선진국에서 사망률과 병적 상태의 주요 원인을 나타냅니다. 약물 개발의 주요 과제는 정확하게 체외에서 정상과 병에 걸린 인간의 심근 생리를 요점을 되풀이 세포 assays의 식별합니다. 마찬가지로, 재생 심장 생물학의 주요 과제는 임상 적으로 관련성이 높은 수량의 환자 별 심장 progenitors의 식별 및 격리 중심으로. 이러한 세포는 따라서 spatially 세포 접착을 제어하는 기하학적 단서를 제공. Microcontact 인쇄는 심장의 구조 조직과 유사한 정확한 micropatterned 단백질 형태의 생성을 허용 네이티브 심장 조직 구조 유사 기능 조직으로 조립해야합니다. 여기에우리는 높은 체외, 세포 외 기질 단백질과 micropatterned 세포 성장 표면의 생성에 차별화 만능 줄기 세포로부터 심근 세포를 정화의 고립에 대한 우리의 접근 방식을 설명하고, 비 등방성 심근 조직에 줄기 세포 유래 심장 근육 세포의 조립.

서론

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의료 치료의 최근 발전에도 불구하고, 고급 심장 마비는 선진국에서 사망률과 병적 상태의 주요 원인으로 남아 있습니다. 임상 증후군은 기능성 심근 조직의 손실과 영향을받는 개인의 신진 대사 요구를 충족 할 수있는 실패 심장의 이후 무능력으로부터 나옵니다. 심장이 제한된 재생 능력을 가지고 있기 때문에, autologous 심장 이식은 직접 손실 기능 심장 조직을 보충하기위한 유일한 현재 임상 적으로 받아 치료입니다. 기증 마음의 제한된 수의 및 장기 면역 억제 치료를 위해,이 치료의 넓은 확산 사용을 배제 할 필요 포함한 심장 이식의 상당 단점. 결과적으로, 의료 치료는 심장 질환 환자에 대한 치료의 의지가되는 것이었습니다. 약물 개발의 주요 과제는 정확하게 체외에서 정상과 병에 걸린 심근 생리를 요점을 되풀이 세포 assays의 식별합니다.

줄기 세포 생물학 및 조직 공학 기술의 최근 컨버전스는 심장 재생을위한 새로운 유망 도로를 발생시킵니다. 재생 환자 특정 소스에서 기능성 심근 조직을 생성하면이 분야의 주요 사전 것입니다. 이 약물 개발 및 발견을위한 질병 특정 세포 assays의 개발을 허용하고 심장 재생 의료의 기반을 마련합니다. 인간 배아 줄기 (ES) 세포와 더 크게, 인간 유도 만능 줄기 (IPS) 세포는 심실 전구 세포와 성숙 심실 근세포의 잠재적 재생 환자 특정 소스를 나타냅니다. 줄기 세포 생물학 및 조직 공학 전략의 조합은 약물 발견 또는 고급 심장 마비의 치료를위한 심장 재생 방법으로 세포 assays의 개발에 사용할 수 있습니다 체외에서 기능 심장 조직을 생성하여이 문제를 해결합니다.

_content "> 심장 재생의 중심 과제는 최적의 세포 유형의 식별되었습니다. 다양한 소스의 다른 multipotent cardiogenic 전구체가 발견되었습니다 있지만, 세포의 다양한 배열을, 그러나 지금까지 세포의 식별을 1 연구 한 예를 myogenic 세포의 운명에 대한 헌신과 같은 중요한 요구 사항을 충족 소스는 기능 심근 조직에 생체 나 생체과 구성에 확장 할 수있는 용량의 유지 보수 중심 문제가이 것으로 증명되었습니다. 우리는 이전에 두 유전자 변형 손쥐 시스템을 설명했습니다 그 높은 체외에서 차별화 ES 세포에서 헌신적 인 심실 progenitors (CVP)의 인구를 정화의 고립을 할 수 있습니다. 우리는 MEF2c 유전자의 Isl1에 의존 증강의 통제하에 dsRed 빨간색 형광 단백질을 표현하는 소설 두 유전자 변형 마우스를 생성하고 의 통제하에 강화 된 녹색 형광 단백질심장 별 Nkx2.5 증강. 이 두 색의 형광 기자 시스템, MEF2c 및 Nkx2.5 유전자의 표현에 따라 형광 활성화 셀 정렬 (FACS)에 의해 분리 될 수 개발 ES 세포에서 첫 번째와 두 번째 심장 필드 progenitors을 기반으로합니다. CVP는 심장 조직 재생을 위해 큰 약속을 제공하는 심근 마커 및 구조와 기능 특성 3의 표현 패턴에 따라 심장 근세포 유사.

조직 공학의 분야에서 많은 발전이있었습니다했지만, 원시 세포 구조를 모방하는 것은 중요한 도전 남아있다. 이 문제를 해결하기 위해 기존의 방법은 체외에서 세포와 퍼 뜨리고 생물학적 또는 합성 공사장 공중 발판이 포함되어 있습니다. 빠른 저하, 제한된 물리적, 기계적 안정성과 낮은 세포 밀도 1,4,5 등의 공사장 공중 발판의 단점의 숫자로 인해, 우리는 비계없는 조직을 처리하려고 시도했습니다. Alt 키무릎 심장 세포는 세포 외 기질 단백질의 분비에 의해 지역 microenvironment을 수정할 수 있습니다, 그들은 세포 신호의 부재에로드 모양의 심장 근세포에 자신을 정리하는 더 제한된 용량을 갖추고 있습니다. 따라서, 기능 심근 조직을 구성하는 세포 적절한 공간 및 생물학적 단서를 제공하는 템플릿이 필요합니다. Microcontact 인쇄 정확하게 정렬 기능 심근 조직의 생성에 중요한 모든있는 세포 모양, 조직 및 기능 6-8을 제어 할 수있는 간단하고 저렴한 방법을 제공하여이 문제를 해결합니다. 그것은 정확한 패턴에 PDMS 기판에 세포 외 기질 단백질의 증착을 가능하게하므로 spatially 세포 접착에 영향을 미치는 2 μm 9 다운 이르기까지 기능 크기로 microtextured Polydimethylsiloxane (PDMS) 우표의 사용을 포함한다.

여기, 우리는 줄기 cel과 조직 생체 공학 기술을 결합하는 제안리터 생물학은 비 등방성 기능 심근 조직을 생성합니다. 따라서, 우리는 여기에 다음에 대한 최근 게시 된 접근 방식을 보여줍니다 : (1) 정렬 심근 조직에 대한 템플릿의 생성에 대한 microcontact 인쇄에 의한 PDMS 기판에 micropatterned 단백질 표면의 생성 (2) 높은에서 심장 progenitors을 정화의 분리 ES 세포는 체외에서 차별화, 그리고 (3) 생성하는 두 기술의 결합 기능 심근 조직을 정렬.

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프로토콜

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정렬 기능 심근 조직을 생성 할 수있는 프로토콜은 세 가지 주요 부분으로 나눌 수 있습니다. 소프트 리소그래피 기술을 사용하여 micropatterned 마스터의 제조는 다음 프로토콜의 일부로 간주되지 않습니다하지만 기존의 방법 6을 기반으로 만들 수 있습니다.

1. PDMS 기판 위에 Fibronectin의 Microcontact 인쇄

  1. 에이전트 비율과 가스를 제거하다하는 기포를 제거 할 수있는 건조기를 사용하여 어셈블리를 치료에 10시 1분 기지에 Sylgard 184 (다우 코닝) PDMS 엘라스토머를 섞는다.
  2. ° C가 microtextured PDMS 스탬프를 얻는 65의 실내 온도 또​​는 4 시간 2 일 중 하나에 대해 20 μm 간격으로 구분하여 20 μm 폭, 2 μm 높이 산등성이와 이전에 제조 된 마스터,에 대한 PDMS 치료.

* 건조기에 경화가 높은 공기 방울을 제거하는 것이 좋습니다.

  1. 유리 커버 용지 (예를 들면 위에 스핀 코트 PDMS15 μm 두께의도 얇고 PDMS 기판을 생산하는 전진의 스핀 Coater를 사용하여 2 분 5,000 rpm으로 22x22 mm).
  2. 먼지와 먼지 입자를 제거하는 70 %의 에탄올과 우표를 청소합니다. 그 공기가 건조 보자.

* 우표는 여러 번 사용할 수 있습니다 그러나, 정기적으로 PDMS 스탬프를 갱신하는 것은 시간이 지남에 따라 표면의 마모로 인해 권장합니다.

  1. 275 mTorr에서 1 분을위한 SPI 플라즈마 준비 II 플라즈마 클리너 및 프로세스의 장소 우표는 PDMS 표면은 친수성 ​​렌더링합니다.

* 산소 플라즈마 처리는 감시해야합니다. 긴 치료 시간은 탄성체의 균열이 발생할 수 있습니다.

  1. 1 분에 70 %의 에탄올과 우표를 검사. 압축 공기를 신속하게 말린다.

* 더 자세한 단계는 불임을 유지하기 위해 생물 안전 캐비닛에 수행해야합니다.

  1. F와 표면에 도장을 찍어 커버ibronectin 솔루션 (ddH 2 O 50 μg / ML). 이 adsorb 적어도 10 분 봅시다.
  2. 우표에서 Fibronectin 솔루션을 흔들어서 압축 공기를 빠르게 건조.
  3. 2 분에 우표와 PDMS 기판 사이의 등각 접촉을 설정하고 단단히 누르십시오.
  4. ddH 2 O.있는 micropatterned 기판을 씻어 처음 사용 ° C 않는 4에 2 주 최대 ddH 2 O에 보관하십시오. ddH 2 O.에 저장 PDMS 우표

2. 더블 트렌스 제닉 배아 줄기 세포 라인의 유지 보수

첫째, 배양 마우스 ES 세포에 대한 다음 미디어를 준비 :

마우스 배아 섬유 아세포의 (MEF) - 중간 : Dulbecco의 수정 된 이글 중간 (DMEM) 10 % 태아 소 혈청 (FBS) ES 세포 또는 차별화 급, 1 % 페니실린 - 스트렙토 마이신 (P / S)

배아 줄기 세포 (ESC) - 중간 : DMEM 15 % FBS ES 세포 급1 % 비 필수 아미노산 (NEAA), 0.5 % P / S, 0.2 % 백혈병 억제 팩터 (난생), 0.0007 % 2 메르 캅토 에탄올 (2-ME)

  1. 멸균 0.1 % ddH 2 O의 젤리 37에서 adsorb 15 분 봅시다 ° C.와 코트 6 - 잘 접시
  2. 원뿔 튜브에 해동 나누어지는에서 50 ML PBS에 MEFs를 추가하고 5 분 1,000 RPM에서 그들을 원심 분리기. MEF - 중간에 Resuspend MEFs.
  3. 우물에 흡착, 기음 초과 젤리와 추가 MEFs 후. MEFs 일일 첨부 할 수 있습니다.

* 3 6 - 잘 접시에 10,000,000 MEFs의 충분 나누어지는.

  1. MEFs을 첨부했을 때, 원추형 튜브에서 해동 나누어지는에서 50 ML PBS에 ES 세포를 추가하고 5 분 1,000 RPM에서 그들을 원심 분리기. Resuspend의 ES의 ESC - 매체와 MEFs가 포함 된 우물에 추가의 셀. ESC - 중간의 문화 ES 세포는 합류 할 때까지 가실 수 있습니다.

* 일단 ES 세포는 passaging는 requ이 합류를하고 있습니다 도달전면에 자라 난을 피하기 위해와 ES 세포 식민지를 유지하기 위해 ired.

  1. passaging에 ES 세포를 준비합니다. 기음 ESC - 매체와 멸균 PBS로 한 번 씻는다.
  2. PBS를 대기음과 트립신 500 μl를 추가합니다. 37 번 프로세스 3.5 분 ° C.
  3. ES 세포 식민지를 해제하고 ESC-매체 500 μl로 중화하기 위해 여러 번 다운 트립신 솔루션을 피펫합니다.
  4. 원하는 비율에 따라 통로 ES 세포는있는 다른 잘에 대한 예를 전송 33 μl은 이전에 통과 30분의 1에 MEFs을 준비했습니다. ESC - 중간에 ES 세포를 유지하고 있습니다.

* 30분의 1의 통과 비율은 ES 세포는 3 일 이내에 합류에 도달 할 수 있습니다. 통로 ES 세포는 체외에서 차별화 일정에 따라.

3. 더블 트렌스 제닉 배아 줄기 세포 라인과 심장 Progenitors의 절연 및 심는의 체외 차별화에

먼저, followi을 준비NG 미디어는 ES 세포의 체외에서 차별화가 필요 :

적응 - 중간 : Iscove의 수정 된 Dulbecco의 중간 (IMDM), 15 % FBS ES 세포 학년, 1 % NEAA, 0.5 % P / S, 0.2 % 난생, 0.0007 % 2-ME

차별화 - 중간 : IMDM, 15 % FBS 차별화 급. 1퍼센트 NEAA, 0.5 % P / S, 0.1M의 아스코르브 산의 ​​0.35 %, 0.0007 % 2-ME

  1. ES 세포는 합류에 도달했을 때 체외 차별화에 시작합니다. 멸균 0.1 % ddH 2 O의 젤리 37에서 adsorb 15 분 봅시다 ° C.와 코트 10cm 문화 요리

*에서 체외 분화 과정의 기간을 인식합니다. 심장 progenitors은 분리 할 수 있습니다 때까지 8 일이 소요됩니다. 이에 따라 실험을 계획합니다.

  1. 이전으로 수확 ES 세포. 흡착, 기음 초과 젤리 후 및 조리 문화에 ES 세포 현탁액의 약 1/3-1/2 추가적응 - 미디어를 포함하는 요리. 2 일간 문화 세포.

* 당신의 실험에 따라 적응을위한 ES 세포의 양을 선택합니다.

  1. 수확은 1을 사용 PBS​​를 포함하는 50 ML 원뿔 튜브에 ES 세포를 적응. 트립신 5 ML. 5 분 1,000 rpm으로 dissociated ES 세포를 원심 분리기와 차별화 - 중간에서 그들을 resuspend.
  2. 멀티 채널 피펫을 사용하여 15cm 문화 요리 10 μl 드롭 당 약 1,000 세포의 embryoid 기관 (EBS)를 확인합니다. 37 2.5 일 동안 방울을 걸려으로 접시와 문화 EBS로 바꾸 ° C.
  3. 2.5 일 후에 한 37 더 3.5 일 동안 차별화 - 미디어와 문화를 사용 ° C.에 6-8 15cm 문화 요리 수영장 EBS
  4. 3.5 일 후, 원추형 50 ML 튜브에 EBS를 수집하고 약 5 분의 바닥에 가라 앉을 보자. 표면에 뜨는을 빨아 및 멸균 PBS와 EBS을 씻는다. EBS는 appr에 대한 아래에 다시 침몰하자oximately 5 분 거리에 있습니다.
  5. 2를 처리하여 EBS를 떼어 놓다. 37 번 물 목욕에서 2 분에 트립신의 5 ML은 ° C 부드럽게 튜브를 흔들어. 그런 다음, 2를 추가합니다. 5 트립신 솔루션에 멸균 PBS의 ML과 10 ML 혈청 학적 피펫으로 세포 클러스터를 무너 뜨리는 약 8-10 시간을 위아래로 피펫. FACS 버퍼의 10 ML은 7.5 % PBS에서 FBS ES 세포 또는 차별화 급 및 0.01 % DAPI를 포함하는과 트립신을 중화.
  6. 5 분 1,000 rpm으로 dissociated EBS를 원심 분리기와 FACS 버퍼의 약 1 ML에서 그들을 resuspend. 1 ML의 피펫으로 세포 클러스터를 무너 뜨리는 약 8-10 시간을 위아래로 피펫.

* dissociated EBS의 예상 금액에 따라 FACS 버퍼를 추가합니다. 너무 높은 집중 세포는 FACS 동안 방해 할 수 있으며 너무 낮은 농축 전지는 불필요 FACS 시간을 연장 할 수 있습니다.

  1. 얻기 위해 35 μm 셀 스트레이너와 살균 내내 아래로 튜브에 세포를 전송하나의 세포 현탁액.
  2. 정렬 차별화 된 ES 세포는 FACSAria 흐름 Cytometer를 사용하고 CVP의 인구를 정​​화 얻습니다.

* 우리는 매우 정제 된 색 세포를 분리 할 수있는 여러 단계 게이팅 전략을 개발했습니다. 간단한에서, 우리는 앞으로 분산 진폭 (FSC-A)과 측면 분산 진폭 (SSC-A) (그림 1A)에서 첫 번째 게이트. 이것은 우리가 세포의 잔해로부터 전체 세포를 분리 할 수 있습니다. 우리는 다음 FSC-A 및 앞으로 분산 - 폭 (FSC-W) (그림 1b)에 게이트. 이것은 우리가 doublets 및 기타 휴대 집계에서 셀 singlets를 분리 할 수 있습니다. 우리는 다음 SSC-A와 사이드 분산 - 폭 (SSC-W) (그림 1C)에 게이트. 이 셀 singlets의 순도를 증가시킨다. 우리는 DAPI에 게이트가 아닌 가능한 세포 (그림 1D)에서 가능한 세포를 (DAPI - 제외) 격리 얼룩. 우리는 다음 Phycoeryhthrin 진폭 (PE-A)와 PE-Cyanine 염료 7 진폭 (PE-Cy7-A) 진정한 붉은 긍정적 (R를 얻을 수에 대한 게이트 + 를 한모금)와 진실 (R 붉은 부정적 -) 세포와 autofluorescent 붉은 부정적인 세포를 (그림 1E)을 제외 할 수 있습니다. R +와 R - 이러한 인구 (그림 1 층에서 세포 + - 셀 Fluorescein의 isothiocyanate의 진폭 (FITC-A)와 PE-A 진정한 녹색 긍정적 (G +), 그리고 진실 (G) 녹색 부정적인를 정렬하려면에 별도로 한 후 출입을 금지 아르 1G). 다음과 같이 셀의 4 인구에있는이 결과 : R + G +, R + G - R - G +와 R - G - (그림 1H).

  1. 10 분에 ddH 2 O의 1 % Pluronic F-127과 micropatterned 기판을 패시베이션. 그런 다음, 멸균 PBS 사람에게 3 배 씻는다.

* Pluronic F-127을 차단하는 세포 접착 계면 활성제입니다. 이 micropatterned 지역에 세포 접착의 제한을 지원합니다.

  1. 무늬가 지역 주변 PDMS의 가스켓을 첨부단단히 누르십시오. Fibronectin micropatterned 기판 위에 그런 다음, 시드 CVP.

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결과

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체외 차별화 된 ES 세포에서의 FACS - 정화는 progenitors의 뚜렷한 인구 (그림 1)을 공개했다. micropatterned Fibronectin의 존재는 지속적으로 Fibronectin 라인 (그림 2)의 전체 전송을 표시 immunofluorescence 현미경으로 확인되었다. G + 인구 - Fibronectin micropatterns로 FACS 절연 progenitors의 도금은 R + G +와 R의 일부 정렬되었습니다. Pluronic F-127 세포 접착의 지원 차단기가 사용 된로했지만, R + G - 그리고 R - G - 인구는 Fibronectin의 비 등방성 구조를 존중하고 인접 단백질 라인 (그림 3) 사이의 공간으로...

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토론

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이 프로토콜에서는, 우리는 그들을 정렬하고 심장 myocyte 같은로드 모양을 할 수 있습니다 어떤 cardiogenic progenitors의 정화 인구를 분리하고 micropatterned Fibronectin 기판에 씨앗을에 할 수있는 방법을 제시했다. 일반 세포 조직은 심근 조직에 대한 특히 정상 조직 기능 8,10에 대한 중요합니다. 심장 근세포는 비 등방성 셀 배열을 형성 할 때 향상된 기계적 11,12 및 electrophysiological 속성 11,13을 개발하기 위해 표시되었습니다. micropatterned Fibronectin 기판에 배양 심장 progenitors은 체외에서 막대 모양의 심근 세포로 분화 이후,이 심장 조직 생체 공학에서 apivotal 단계를 나타냅니다.

Microcontact 인쇄는 체외에서 심근 조직을 닮은 2 차원 템플릿을 생성하는 데 사...

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공개 사항

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제작자들은 더 경쟁 금융 이익이 없다는 점 선언합니다.

감사의 글

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이 작품은 Nanoscale 시스템을위한 센터 (CNS), 아니 NSF 상 아래에있는 국립 과학 재단 (National Science Foundation)에서 지원하는 국가 나노 기술 인프라 네트워크 (NNIN)의 회원에 부분에 수행되었다. ECS-0335765. CNS는 하버드 대학의 일부입니다.

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재료

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이름회사카탈로그 번호댓글
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L-아스코르브 산 시그마 - 알드리치 A4544 ddH 2 O에 0.1M 솔루션을 준비
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4 ', 6 Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride (DAPI) 생명 기술 D1306
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DPBS Gibco 14,190
FACSAria II 흐름 Cytometer BD Biosciences
태아 소 혈청ES 세포 수준 쌍둥이 바이오 제품 100-106
태아 소 혈청 차별화 급 쌍둥이 바이오 제품 100-500
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Fisherfinest 프리미엄 커버 유리 22x22mm 피셔 과학 12-548-B
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2 - 메르 캅토 에탄올 시그마 - 알드리치 M6250
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페니실린 - 스트렙토 마이신 Gibco 15140-122
Pluronic F-127 시그마 - 알드리치 P2443 ddH 2 O에서 1 %의 솔루션을 준비
라운드 - 어쨌든 튜브 35 μm 셀 스트레이너로 BD Biosciences 352235
SPI 플라즈마 준비 II 플라즈마 클리너 SPI 용품 11005-AB
Sylgard184 실리콘 엘라스토머 키트 다우 코닝 184 SIL ELAST KIT 0.5KG
0.25 % 트립신 - EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) Gibco 25200-056
진공계 SPI 용품 11019-AB

참고문헌

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