혈액과 문화 매체에서 파생 Exosomes의 정화 및 마이크로 RNA 프로파일

요약

exosomes에서 안정 마이크로 RNA (miRNA에)의 존재는 생체로 및 치료 개입에 대한 경로로 자신의 잠재력 유틸리티, 간 커뮤니케이션의 새로운 형태로 엄청난 관심을 생성했습니다. 여기에 우리가 전송되는 miRNA에를 식별하는 정량 PCR에 의해 다음 혈액과 문화 미디어에서 exosome 정화를 보여줍니다.

초록

안정되어있는 miRNA의 모든 체액에 존재하는 어떤 순환의 miRNAs는 exosomes라는 작은 소포에 격리에 의해 분해로부터 보호됩니다. Exosomes는 대상 세포에 RNA와 단백질의 이동의 결과 세포막과 융합 할 수 있습니다. 자신의 생물학적 기능은 면역 반응, 항원 프레 젠 테이션 및 세포 통신을 이용하실 수 있습니다. 혈액을 통해받는 사람 세포에서 유전자 발현을 조절할 수있는 miRNA의 배달 대상의 개입에 대한 새로운 길을 열었습니다. 약물이나 RNA 치료제의 전달을위한 전략을 제공 할뿐 아니라, exosomal 내용은 처리 옵션 및 예후를 결정하는 진단에 도움이 될 수 있습니다 생체 역할을 할 수 있습니다.

여기에서 우리는 양적으로 혈액과 세포 배양 배지에서 분비 exosomes에서의 miRNAs 및 메신저 RNAs (mRNA의)를 분석하기위한 절차를 설명합니다. 정제 exosomes는 EXOS을위한 서양 얼룩 분석을 사용하여 특성화 될 것입니다관심의 mRNA에 대한 OMAL 마커와 PCR. 투과 전자 현미경 (TEM)과 immunogold 라벨은 exosomal 형태와 무결성을 검증하는 데 사용됩니다. 총 RNA는 우리가 동일한 샘플의 발현 및 miRNA의 모두 공부를 할 수 있도록 이러한 exosomes에서 정화 될 것입니다. Bioanalyzer에 의해 RNA 무결성을 검증 후에, 우리는 TAQMAN 저밀도 어레이 (TLDA) 카드와 그 성적에 대한 유전자 발현 연구를 사용하여 exosomal miRNA의를 식별하는 중간 처리 정량 실시간 PCR (qPCR에)을 수행합니다.

이러한 프로토콜은 약물 개입 전후 환자, 설치류 모델 및 세포 배양 매체 exosomal의 miRNAs의 변화를 정량화하는 데 사용할 수 있습니다. Exosomal 내용으로 인해 원래의 소스와 분비 exosomes 그 세포의 생리적 상태에 따라 다릅니다. 이러한 변화는 세포 시스템이 스트레스 생​​리 교란에 대처하는 방법에 대한 통찰력을 제공 할 수 있습니다. 우리의 대표적인 데이터는 V 표시miRNA에있는 ariations 마우스 혈액, 인간의 혈액과 인간의 세포 배양 매체에서 정제 exosomes에 제시한다.

여기에서 우리는 양적으로 혈액과 세포 배양 배지에서 분비 exosomes에서의 miRNAs 및 메신저 RNAs (mRNA의)를 분석하기위한 절차를 설명합니다. 정제 exosomes의 관심의 mRNA에 대한 exosomal 마커와 PCR을위한 서양 얼룩 분석을 사용하여 특성화 될 것입니다. 투과 전자 현미경 (TEM)과 immunogold 라벨은 exosomal 형태와 무결성을 검증하는 데 사용됩니다. 총 RNA는 우리가 동일한 샘플의 발현 및 miRNA의 모두 공부를 할 수 있도록 이러한 exosomes에서 정화 될 것입니다. Bioanalyzer에 의해 RNA 무결성을 검증 후에, 우리는 TAQMAN 저밀도 어레이 (TLDA) 카드와 그 성적에 대한 유전자 발현 연구를 사용하여 exosomal miRNA의를 식별하는 중간 처리 정량 실시간 PCR (qPCR에)을 수행합니다.

이러한 프로토콜은 exosomal의 miRNAs의 변화를 정량화하는 데 사용할 수있는 전약물 개입 전후 N 환자, 설치류 모델 및 세포 배양 매체. Exosomal 내용으로 인해 원래의 소스와 분비 exosomes 그 세포의 생리적 상태에 따라 다릅니다. 이러한 변화는 세포 시스템이 스트레스 생​​리 교란에 대처하는 방법에 대한 통찰력을 제공 할 수 있습니다. 우리의 대표적인 데이터의 miRNAs의 변화 마우스 혈액, 인간의 혈액과 인간의 세포 배양 매체에서 정제 exosomes에 존재하는 표시

서론

짧은 비 암호화의 miRNAs는 대상의 mRNA에 결합하여 유전자 발현을 조절. ~ 7 기본 쌍의 씨앗 시퀀스 보완은 번역의 억제 또는 대상 단백질 ^1의 감소 표현 될 수 있습니다 둘 다의 mRNA의 안정성 감소의 결과로 대상의 mRNA에 결합하는 miRNA의 수 있습니다. 지난 10 년간 연구 명백하게 세포 기능을 중재에 miRNA에 대한 근본적인 역할을 입증했다. 또한 각종 질병에게 ^2,3 기본 miRNA의 매개 분자 변화를 해부쪽으로 이동 상당한 노력이 있었다. 또한, 체액 ^4-6에서 안정 miRNAs는 최근 식별 임상 진단 의무 새로운 바이오 마커 등의 사용에 대한 방법을 용이하게했다.

체액의 miRNA의 전송 모드 하나는 조직의 혈액 circulat를 통해받는 세포에 exosomes, mRNA를 운반 작은 소포, 단백질, 지질 매개체, 그리고 miRNA에 경유이온 ^7-14. 받는 사람 세포에서 유전자 발현의 변조,이 결과는 세포 통신의 새로운 메커니즘을 나타냅니다. 예를 들어, 세포 성장 인자-β5 (TGFβ5)를 변환, 분비 및 / 또는 인터루킨-1β (IL1β), 종양 괴사 인자-α (TNFα)와 같은 염증과 관련된 생체 분자를 포함하는 흡수 exo....

프로토콜

인간과 설치류의 혈액 샘플을 사용하여 모든 실험은 모든 관련 지침, 규정 및 규제 기관 준수에 실행되었다. 사람을 대상으로이 약 기관 검토위원회의 드렉 셀 대학과 동물을 사용하여 수행 연구에 대한 모든 절차 드렉의 기관 동물 관리에 의해 승인 및위원회를 사용했다가 승인 한 동의서를 제공 한 후 등록되었습니다.

1. 혈액에서 Exosome 정화 (~ 5.5 시간)

팁

• 우리는 mirVana의 miRNA의 절연 키트에서 300 μL RNA 용해 버퍼의 혈액 튜브 1 (~ 10 ㎖ 인간의 혈액과 1 ~ 2 ML 마우스 혈액)에서 exosomes를 resuspend을.
• 세포 배양 매체에서 exosomes을 정화, 미디어 세포를 제거하기 위해 10 분 500 XG에 스핀도 12,000 X g에서 원심 분리 한 후 필터 0.22 μm의를 통해 필터링됩니다. 세포 배양 매체에서 exosome 정화PBS, PBS 세척 또는 제 원심 단계에서 희석이 필요하지 않습니다.
• 정제 exosomes는 원심 단계 이후 자당 기울기 원심 분리 단계를 추가, ....

결과

혈액이나 세포 배양 매체에서 exosomes를 분리 한 후, exosomes의 순도는 전자 현미경 (EM)와 서양 얼룩 (그림 1A와 1B)에서 테스트 할 수 있습니다. 우리는 EM 여러 항체를 사용하여 서양 얼룩으로 다양한 소스로부터 우리 exosome 준비를 확인했다. 그림 1A는 exosomes는 ~의 직경 30 ~ 100 m로 그대로이며, immunogold 라벨로 CD81를 포함하는 것을 확인 EM 이미지를 보여줍니다. 일반적으로 사용되는 exosomal 마커 Hsp70의 및 tetraspannin 가족 당 단백질 CD63, CD81과 CD9 ^14아르. 정제 exosomes의 무결성을 확인한 후, 우리는 그림 1B에있는 Hsp70의에 대한 서양 얼룩을 수행하고 미디어를 혼자 (대조군)하지 않지만 exosomes는 Hsp70의 포함 된 것으로 나타났다. Bioanalyzer 추적 RAW 세포 배양 매체에서 격리.......

토론

이 프로토콜에서는, 우리는 혈액과 문화 미디어 차등 원심 분리하여 정제 exosomes에서의 miRNAs과의 mRNA의 정량을 보여줍니다. Exosomes는 그들의 기원에 의존 다양한 구성 요소가 면역 반응, 항원 제시 세포 내 통신 및 RNA와 단백질 ^{9,11,12,19,20의} 전송을 포함한 생물학적 기능의 숫자에 참여하고 있습니다. 크기와 모양이 exosome 순도의 결정이지만, EM에게 exosomes의 데이터를 표시 논문의 숫자는이 소포는 그들이 고정을 위해 사용되는 방법뿐만 아니라 분비되는 소스 및 영상 ^9에 따라 크기와 형태에 이르기까지 다양 할 수 있음을 나타냅니다 ^15. 30-100 ㎚의 exosomes에 허용되는 크기는 소스 ^21,22, 여러 방법이 exosomal 순도의 유효성을 검사하는 데 사용되는 하나의 이유에 따라 큰 직경 exosomes의 작은 인구를 포함하는 평균 범위입니다. 분비의 miRNAs는 많은 필수 featur있다.......

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
EDTA 코팅 바큐테이너(10ml 튜브)	BD 진단	366643	인간 혈액에서 엑소좀 정제
EDTA 코팅 바큐테이너(2ml 튜브)	BD 진단	367841	마우스 혈액에서 엑소좀 정제
PAXgene 혈액 RNA 튜브	BD 진단	762165	총 혈액에서 miRNA 분리용
miRVana microRNA 분리 키트	Ambion	AM1561
산-페놀 : CHCl3	Ambion	9721G
DNase 1	Qiagen	79254
TaqMan 범용 PCR 마스터 믹스, 없음 AmpErase UNG	Applied Biosystems	4326614	TLDA 카드
용 Megaplex RT 설치류 풀 세트 v3.0	Applied Biosystems	4444746
Megaplex 프리 앰프 설치류 풀 세트 v3.0	Applied Biosystems
4444747 Taqman Array 설치류 MicroRNA A+B 세트 V3.0	Applied Biosystems	4444909
Megaplex RT Human Pool set V3.0	Applied Biosystems	4444745
Megaplex Preamp Human Pool set v3.0	Applied Biosystems	4444748
Taqman Array Human MicroRNA A+B Cards Set v3.0	Applied Biosystems	4444913
Taqman MicroRNA RT kit	Applied Biosystems	4366596
Taqman fast universal PCR 마스터 믹스	Applied Biosystems	4366072	mRNA qRT-PCR
종양 괴사 인자 (프라이머 프로브)	Applied Biosystems	Hs01113624_g1
혈관 내피 성장 인자 A (프라이머 프로브)	Applied Biosystems	Hs00900055_m1
Maxima First Strand cDNA RT-qPCR용 합성 키트	Thermo Scientific	K1642	mRNA
HSP70 항체	Abcam	ab94368	웨스턴 블롯
IgG-Gold	Sigma	G7402	전자 현미경용
Rabbit-anti CD81	Sigma	SAB3500454
Nickel 300 mesh carbon formvar grids	전자 현미경 과학	FCF300-Ni
구리 300 메쉬 탄소 formvar 그리드	전자 현미경 과학	FCF300-Cu
표 1. 특정 시약 표.

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