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Abstract
Introduction
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Medicine

설치류 비뇨 부비동 간엽 및 인간 줄기 세포의 조직 재조합을 사용하여 인간의 전립선 상피의 형성

Published: June 22, 2013
doi:
10.3791/50327
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, ,
1Department of Surgery, Section of Urology,University of Chicago, 2Committee on Cancer Biology,University of Chicago

Summary

전립선 암의 개시, 소설과 혁신적인 인체 모델 시스템과 방법을 기본 최초의 분자 메커니즘이 절실히 필요 해명합니다. 인간의 전립선 상피 세포를 형성하는 만능 줄기 세포 인구를 유도하는 사전 전립선 비뇨 동 간엽 (UGSM)의 가능성이 전립선 연구에 강력한 실험 도구입니다.

Abstract

전립선 암 연구의 발전에 심각한 전립선 질환의 개시를 기본 유전 및 분자 이벤트를 이해하는 우리의 능력을 제한하는 인간의 유래와 호르몬 순진 모델 시스템의 가용성에 의해 제한됩니다. 발암 인간의 전립선을 공부하고 더 나은 모델 시스템을 개발을 목표로, 우리와 다른 배아 쥐 전립선 기질의 고유 한 프로 전립선 유도 가능성의 장점을 가지고 비뇨 동 간엽 (UGSM을)라고했다. 이러한 배아 줄기 세포와 같은 특정 만능 세포 인구와 재결합 할 때, UGSM은 남성 호르몬 의존적으로 정상적인 인간의 전립선 상피의 형성을 유도합니다. 이러한 인간의 모델 시스템을 조사하고 실험적으로 일반적인 설치류 형질 전환 연구에 비해 가속 속도로 후보 전립선 암 감수성 유전자의 능력을 테스트하는 데 사용할 수 있습니다. 인간 배아 줄기 세포 (hESCs는) 유전자의 문화저기서에서 수정 될 수 있기 때문에조직 재조합하기 전에 G의 유도 유전자 발현 또는 siRNA를 노크 다운 벡터, 같은 모델은 유전자의 기능 결과를 테스트 용이하게하거나 촉진하거나 발암 방지하기 위해 생각되는 유전자의 조합.

UGSM 세포의 순수한 인구를 분리하는 기술은, 그러나, 도전과 자주 학습 이전의 전문 지식을 갖춘 사람이 개인적으로 가르 칠 수 있어야합니다. 또한, 면역 호스트의 신장 캡슐 아래 세포 혼합물의 접종은 기술적으로 도전 할 수 있습니다. 여기에서 우리는 개요와 쥐의 배아와 인간의 전립선 상피 세포를 형성하는 조직 혼합물의 신장 캡슐 주입에서 UGSM의 적절한 차단을 보여줍니다. 이러한 접근 방식은 현재 단계에서 배아 줄기 세포의 xenografting 생체 내에서 필요하며 미래의 응용 프로그램은 잠재적 생체 선 형성 또는 유도 된 pluripotent 줄기 세포 인구 (유도 만능)의 사용을 포함 할 수 있습니다.

Introduction

전립선 암의 더 나은 인간의 모델 시스템에 대한 엄청난 필요가있다. 특히, 유전자 직접 전립선 암의 개시에 특정 유전자의 역할을 식별하는 조작 할 수있는 일반적인, 비 악성 전립선 조직의 관련 인간의 모델 시스템은 매우 유익한 것입니다. 게놈 시대의 도래는 암 형성에 역할을 할 수 많은 유전자를 발견했다. 실험 인간의 모델 시스템의 부족은, 그러나, 심각한 기능적 테스트 후보 전립선 암 감수성 유전자를 특성화하는 능력을 손상. 이상적인 모델 시스템은 적절한 형질 전환 설치류 모델 시스템과 함께 암 감수성 유전자의 신속하고 더 빠른 기능 분석을 용이하게한다. 또한, 이러한 인간의 모델 시스템에 대한 새로운 치료법의 발견 및 검증을 향해 발암 전립선의 신호 메커니즘을 분자 특성을 가능하게 할전립선 암의 형성을 방지합니다.

인간 배아 줄기 세포 (hESCs에) 이종 이식으로 인간의 전립선 조직을 형성 할 수있다. 2006 년 테일러 등은. hESCs는이 8-12주의 기간 내에 설치류 비뇨 동 간엽 (UGSM)와 다시 결합 될 때 생체 내에서 전립선 상피 세포를 형성하도록 유도 될 수 있음을보고 하였다. 1이 연구에 의해 이전 작업을 기반으로 한 그 쥐 배아 UGSM을 보여주는 쿤하의 연구소는 2,3 전립선은 비뇨 생식기 동 (UGS)라고 배아 ANLAGEN에서 개발하고 있습니다. 줄기 세포 및 생체 내에서 배아 상피 세포 인구의 전립선 분화를 촉진하고, 이전의 배아 일 17 (마우스 E17 수 있습니다 , 쥐의 하루 E18) UGS를 제거하고 물리적으로 분할 상피 세포 (UGSE)에와 간엽 (UGSM 4)이 조직 재조합 방식은 크게 전립선 개발 및 발암, 특히 우리의 이해를 강화했다 할 수 있습니다.LY 성장 인자와 호르몬 신호 전달 경로와 전립선 기질과 상피 세포 사이의 분자 관계. 5-8이 방법은 줄기 동일하거나 서로 다른 종에서 상피 세포와 UGSM의 생체 조합을 포함하고 이러한 세포 / 조직 재조합는 이식 재배 마우스 호스트에서 이종 이식. 4.9은 생체 내 성장의 기간 후에, 이식 각막 조직에 포함 된 전립선 상피 선의 구조를 포함하고 있습니다. 또한 염색 같은 구조 진정 전립선과 인간의 기원 여부를 확인하기 위해 실시 할 수있다. 10,11

Protocol

이 연구는 건강의 국립 연구소의 실험 동물의 관리 및 사용을위한 설명서의 권장 사항에 따라 엄격 수행 하였다. 프로토콜은 시카고의 기관 애니멀 케어 및 사용위원회의 대학 (IACUC 프로토콜 번호 72066 및 72231)에 의해 승인되었다. 모든 수술은 마취하에 수행되었으며, 모든 노력은 고통을 최소화하기 위해 만들어졌다. 인간 배아 줄기 세포주 WA01 (H1, NIH 등록 # 0043)를 mTeSR1 미디어를 사용하여 장치에 독립적 인 프로토콜을 사용하여 WiCell (매디슨, WI) 배양에서 획득 된 (세포 기술을 줄기, 밴쿠버, BC). ES 세포는 해동 10 구절에서 사용되었다. 1. 마우스 또는 쥐 배아에서 비뇨 부비동의 분리 5 분 동안 CO 2의 흡입에 의해 시간 초과 임신 한 쥐 (일 17.5) 또는 쥐 (일 18.5)를 안락사. 죽음 쥐의 생체 신호의 중단에 의해 확인된다. 다음 인도적의 목을 부러. R시는이 시점에서 안락사 있습니다. 복부 피부와 측면을 소독하기 위해 70 % 에탄올을 스프레이. 복부 피부와 근육 레이어를 절단하고, 자궁을 잘라 양막 낭에서 쥐의 배아를 분리하고, 탯줄을 잘라. 얼음처럼 차가운 행크의 균형 소금 솔루션 (HBSS)를 포함하는 50 ML 팔콘 튜브에 배아를 전송하고 얼음에 보관하십시오. 태아 수술 가위로 잘린 안락사 있습니다. 100mm 페트리 접시에 배아를 놓습니다. 배꼽 (그림 1A)의 수준에서 가위로 배아를 양분. 위장과 소장을 제거합니다. 남성 배아 (그림 1B 및 1C)에서 여성의 배아와 고환의 난소를 알 수있다. (난소 신장의 꼬리 극에 있습니다. 고환은 약 방광의 수준이다). 이 발달 단계에서 UGSM는 남성과 여성 모두 배아 호스트의 면전에서 전립선 상피 혈통을 유도 할 수있다으로부터 격리남성 호르몬 인 테스토스테론을 생산합니다. 4이 발달 시점 후, 그러나, 전립선 싹이 UGSM에 형성 시작하고 순수한 UGSM의 분리는 매우 도전 4. 해부 현미경, 방광과 복부의 뒤쪽 벽을 노출하는 Vannas 가위로 중간 선에있는 복벽을 잘라. 첨부 파일에서 무료로 상부 생식기는 (남성 배아, 요관, Wolffian 덕트 뮬러 덕트를 잘라, 여성 태아에서, 요관 및 뮬러 덕트를 잘라.) 탯줄에서 방광을 해제. 치골과 뒤몽 좋은 팁 집게로 비뇨 생식기 부비동의 앞쪽 벽에서 퉁명스럽게 분리를 잘라. 마지막으로, 직장에서 비뇨 생식기 부비동의 후벽을 분리합니다. 하단 (요도)에서 방광과 비뇨 생식기 부비동을 차단하고 얼음 차가운 HBSS에 비뇨 생식기 공동 욕실 블록을 (방광) 저장합니다. 2. 비뇨 부비동 간엽의 분리 <li> 해부 현미경 (그림 1D)에서 비뇨 동에서 방광을 제거합니다. 1 %의 칼슘 트립신 (칼슘 2 +)과 마그네슘 (MG 2 +) 무료 HBSS를 포함 팔콘 튜브에 비뇨 동을 전송합니다. 75 분 동안 4 ° C에서 냉장고에 튜브를 놓습니다. 트립신을 제거하고 DMEM/F12 배지에서 10 %의 태아 Bovin 혈청 (FBS)와 트립신을 중화. 이것은 줄기 세포에서 파생 된 인간과 함께 형성하는 쥐의 땀샘이 발생할 수 있으며, 조심스럽게 바늘 또는 뒤몽 좋은 팁 포셉 (그대로 상피 관 간엽의 상피 세포 오염의 가능성을 줄일 수 유지와 상피 튜브에서 끈적 끈적한 중간 엽 슬리브를 애타게 선의 상피 세포) (그림 1D) 12. DMEM/F12 배지 + 포함하는 새로운 팔콘 튜브에 UGSM을 전송 10 % FBS + 1 % 페니실린 / 스트렙토 마이신 (펜 / Strep의, 0.5 MG / ML) + 1 % 비 필수 아미노산 (NEAA)과 1NM R1881. 경기 수에이스 37 ° C에서 인큐베이터에있는 관 5 % CO 2 밤새 함께. 200 XG에서 조직을 원심 분리하고 상층 액을 버린다. 인산 버퍼 식염수 (PBS) (조직 펠렛을 방해하지 않습니다)로 씻으십시오. 다시 일시 중지합니다 조직에 0.2 % 콜라게나을 (DMEM/F12)에 추가합니다. 1 시간 동안 부드럽게 흔들 37 ° C에서 알을 품다. 적극적으로 소용돌이 소화 조직을 세 번이 균일 한 단일 셀 혼합되고 DMEM/F12 배지 + 추가 할 때까지 10 % FBS + 1 % P / S + 1 % NEAA + 콜라게나 제를 중화하는 1NM R1881. 200 XG에 원심 분리기 후 HBSS에 UGSM 세포를 다시 중단으로 세척, 완전히 UGSM을 씻어 세 번 반복합니다. 마지막으로 DMEM/F12에서 중간 엽 세포를 중지하고 혈구 또는 셀 카운팅 장치를 사용하여 셀을 계산합니다. Accutase 소화 (, 빌리 카, 매사추세츠 밀리 포아)를 사용하여, HES 세포에게 mTeSR1 미디어 (밴쿠버, BC 줄기 세포 기술)와 함께 배양하여 급지없는 프로토콜을 떼어 놓다. HES 세포를 씻으십시오따뜻한 DMEM/F12 미디어 그들의 성장의 로그 단계에서 다음 따뜻한 1X Accutase 솔루션을 추가하고, 하나의 세포가 식민지에서 균일하게 해리 될 때까지 15 ~ 20 분 동안 37 ° C에서 알을 품다. Accutase을 중화하고 부드럽게 피펫 아래 세포 덩어리를 혼합하고 분쇄​​하기 위하여는, 1X 정의 트립신 억제제 (그랜드 아일랜드, NY Invitrogen 사)의 동일한 금액을 추가합니다. 원심 분리 관 3 200 XG에 분 및 DMEM/F12 미디어 다시 일시 중지 세포 펠렛을위한 원심 분리기 피펫 세포. 200 다시 XG에서 3 분 튜브를 원심 분리하고 상층 액을 제거한 다음 원하는 볼륨 차가운 HBSS이나 DMEM/F12에 다시 일시 중지합니다. HES / 중간 엽 세포의 1:2.5 비율로 HES 세포를 추가합니다. 3이 10 ㎖ 주입 당 4E 4 hESCs는 (하나의 쥐 2E 6 중간 엽 세포에 대한 일반적으로 수율을 UGS)와 1E 5 UGSM 세포의 세포 구성 될 것입니다. 5 분 200 XG에 원심 한 후 상층 액을 버린다. 75 % 마트 리젤 (BD Biosciences의로 다시 일시 중지합니다,산호세, 캘리포니아, 쉬운 취급을위한 25 %의 차가운 HBSS와 혼합)와 하위 신장 캡슐 주입 얼음에 튜브를 놓습니다. 3. 신장 캡슐 밑에 재조합 조직의 이식 무균 수술 영역을 준비합니다. xylazine / 케타민 IP와 남성 athymic 누드 마우스를 마취, 마취제의 1시 1분 8초 비율을 포함하는 신선한 혼합 사용 xylazine : 생리 식염수를. 투약은 100 ㎎ / kg 케타민을 및 2.5 ㎎ / kg Xylazine 될 것입니다. 발가락 핀치에 응답 동물은 완전히 20-30 분 미만이어야합니다. 수술 베타 딘 용액 다음 70 % 알코올의 세 가지 교류 잎사귀와 클렌징 외과 드레이프를 적용, 수술 사이트 (누드 마우스를 사용하지 않는 경우) 면도 마우스를 준비합니다. 마취 동안 건조를 방지하기 위해 마우스의 눈에 눈 습기 연고를 (Altalube 눈 연고) 넣습니다. 수술하는 동안, 생쥐의 호흡 속도와 체온이 모니터링됩니다. 호흡률 소ULD 꾸준한 40-90 심호흡 / 분 내로 유지해야합니다. 체온은 점막의 색상과 다리의 핑크 발바닥의 관찰과 모니터링됩니다. 뒷면에 1.0 cm 긴 길이의 피부 절개를합니다. 0.5 cm 세로 절개의 복벽을 삭감하는 것을 계속한다. 조심스럽게 복부에서 신장을 짜 멸균 생리 식염수 방울을 사용하여 신장 표면의 수분을 유지합니다. 조심스럽게 구멍 빈 27 게이지 주사 바늘을 사용하여 신장 캡슐. 매우 얕은 구멍은 충분합니다. 당신의 세포 혼합물을 주입하기 위해 무딘 바늘을 삽입하는 곳이 될 것입니다. 휴대 혼합물의 10 μL와 28 게이지 무딘 주사기 바늘을 입력합니다. 천천히 구멍 사이트를 삽입하고 신장 캡슐 아래 영역에 도달하기 위해 신장 실질을 관통. 신장 캡슐 아래 신장에 알약을 형성하는 세포 혼합물 10 μl를 주입한다. 철수 바늘을. ABDO에 신장을 반환VIDEO 케이블 구멍. 4-0 나일론 봉합사와 복막의 근육 층을 확보하고 있습니다. 봉합 또는 스테이플 하나와 함께 피부를 닫습니다. 멸균 생리 식염수를 사용하여 피부의 혈액을 청소합니다. 4. 수술 후 진통제 및 모니터링 수술 후 통증, 및 37의 1 ML 동물을 온난 한 유지하기 위하여 ° C 염분 IP를 관리하는 부 프레 노르 핀 (0.1 ㎎ / ㎏ 매 12 시간) 또는 케토 프로 펜 (생리 식염수 매 12 시간에서 3-5 ㎎ / ㎏)와 함께 동물을 주사 탈수를 방지합니다. 깨끗한 새장에 동물을 넣고 약한 가열 패드에 놓습니다. 그들은 의식을 되찾고 케이지 내에서 이동되면 동물 방으로 동물을 보낼 수 있습니다. 다음과 같은 세 가지 일 질병 및 감염의 예상치 못한 징후를 매일 동물을 관찰합니다. 마우스 접근과 음식과 물을 후 수술 일일 포함 새장에있는 활동의 관찰과 모니터링됩니다. 마우스가 적은 활동을 표시하는 경우, 케토 프로 펜은 복강 광고입니다하루에 한 번 다시 사역. 피부 스테이플 또는 봉합 이주 수술 후 제거합니다. 이종 조직은 팔주 수술 후 빨리 수확 할 수 있습니다. 이종 이식은 작은 동물 초음파 (그림 2A) 및 고정 된 조직은 단면과 면역 (그림 3)를 사용하여 다양한 단백질에 대한 염색 할 수를 사용하여 생체 내 이미징 할 수 있습니다.

Representative Results

테일러, 외.에 의해 흥미로운 보고서에 건물, 우리의 실험실은 일반적으로 사용되는 H1 (NIH 지정한 WA01, 유 전적으로 남성) 인간 배아 줄기 세포주 1.이 라인은 엄격한 품질 관리를위한 시험되고 사용 engrafting 프로토콜을 개발했습니다 karyotypically 정상 13 적절하게 배양 할 때, HES 세포가 확장, 유지 및 피더 무료 문화 방법 (줄기 세포 기술을 통해 상업적으로 이용 가능한 장치?…

Discussion

UGSM를 사용하여 조직 재조합 전립선의 개발과 전립선 암의 개시에 이르는 분자 사건을 조사하기 위해 매우 유용한 기술입니다. UGSM의 유도 가능성은 전립선 연구에 많은 응용 프로그램에 사용되어왔다, 이러한 강화 종양 기질 – 상피 상호 작용을 공부하고, 종간 전립선 재조합을 형성, 전립선 세포 라인과 종양 걸릴 포함 UGSM의 7,17-20 적절한 준비. 그러나, 설치류 상피 세포를 오염하는 선?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

우리는 박사 Arieh Shalhav에 의해 주도 비뇨기과 시카고 섹션의 대학 및 Urologic의 연구 박사 캐리 스케이트 타는 사람 – 쉐퍼가 상대역과 베드신의 이사의 지원을 인정하고 싶습니다. 우리는 또한 박사 미셸 르 보에 의해 주도 시카고 종합 암 센터 (UCCCC) 대학의 지원을 인정하고 싶습니다. 우리는 또한 박사 마크 린겐에 의해 주도 인체 조직 자원 센터의 핵심 시설, 레슬리 마틴과 메리 조 Fekete의 도움으로 전문적인 기술 지원을 감사하는 데. 우리는 또한 테리 리에서 운영하는 면역 핵심 시설을 주셔서 감사합니다. 이 작품은 외과 시카고 교실, 비뇨기과 섹션의 대학에 의해 투자되었다; 미국 암 협회 (American Cancer Society) 기관 연구비 (ACS-IRG, # IRG-58-004), 암 센터 지원 그랜트 (P30 CA14599) Brinson 재단 앨빈 바움 가족 기금, 시카고 암 연구 재단 여성위원회의 대학, S. Kregel이 HHMI에 의해 지원됩니다 : 메드 -에 – 졸업생 휄로우엉덩이 (56006772)와 암 생물학 교육 그랜트 (T32-CA09594). 마지막으로, 우리는 원고의 비판적 평가를 위해 로버트 클라크, 박사 VenkateshKrishnan, 나단 Stadick에게 감사의 말씀을 전합니다.

Materials

Name Company Catalogue Number Comments
Hank’s Balanced Salt Solution (HBSS) GIBCO 14170
DMEM/F12 GIBCO 11330
R1881 Sigma 965-93-5 Mix to 1 ug/ml in Ethanol (1,000x stock)
NEAA GIBCO 11140
Pen-Strep Solution GIBCO 15070 100x stock
Matrigel BD Biosciences 354230
KETASET (ketamine hydrochloride) Fort Dodge Animal Health NDC 0856-2013-01 100 mg/ml; dilute 1:10 in sterile saline
AnaSed (xylazine) VET-A-MIX, Inc. NADA 139-236 20 mg/ml; dilute 1:10 in sterile saline
Trypsin BD Biosciences 215240
Collagenase Sigma C2014
Ketoprofen Fort Dodge NDC 0856-4396-01 100 mg/ml; dilute 1:1,000 in sterile saline
Altalube eye ointment Altaire Pharmaceuticals, Inc. NLC 56641-19850
Leica MZ16 F Stereomicroscope Leica Any good dissecting scope can be used.
Vannas spring scissors Fine Science Tools 15001-08
Syringe Hamilton 84855
Hamilton Needle, Small RN, 28 gauge, 0.5inches, Point Style #3 (Blunt) Hamilton 7803-02 Custom Needle
Ethanol Prep Pads Fisher Scientific 06-669-62
Sterile Gauze Pads Fisher Scientific 22-415-469
Ethicon Vicryl Suture (4-0 FS-2) MedVet International J392H Needle-in, dissolvable suture
Autoclip 9 mm Wound Clips Becton Dickenson 427631
PVP Iodine Prep Pads Fisher Scientific 06-669-98
Dissector scissor with blunt end Fine Science Tools 14072-10
Dumont fine tip forceps Fine Science Tools 11252-50
Needle holder with Scissor Fine Science Tools 12002-14
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References

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Cai, Y., Kregel, S., Vander Griend, D. J. Formation of Human Prostate Epithelium Using Tissue Recombination of Rodent Urogenital Sinus Mesenchyme and Human Stem Cells. J. Vis. Exp. (76), e50327, doi:10.3791/50327 (2013).
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