상동 재조합 기술은 크게 발전 초파리 분자 정확한 돌연변이의 생성을 가능하게함으로써 유전학. recombineering의 최근 채용 한 DNA의 큰 조각을 조작으로 그들을 변환 할 수 있습니다 초파리 6. 방법은 신속하게 대규모 상동 재조합 벡터를 생성하기 위해 이러한 기술을 결합하여 여기에 제시 하였다.
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이 논문에서
요약
초록
내생 유전자 좌위의 빠르고 대규모 조작 기술의 지속적인 발전은 인간의 질병 관련 연구를위한 유전자 모델 생물로 초파리의 사용을 확대 할 것이다. 최근 몇 년 동안 상동 재조합 recombineering 같은 기술 발전을 볼 수있다. 그러나 명백한 널 돌연변이 또는 태그 내생 단백질을 생성하는 것은 대부분의 유전자 상당한 노력이 남아있다. 여기, 우리는 생체 내에서 내생 궤적을 대상으로하고 조작하는 데 사용할 수있는 벡터를 생성하는 recombineering 기반 복제 방법을 사용하는 방법을 설명하고 보여 구체적으로, 우리는 세 가지 기술의 조합을 설립했습니다. (1) BAC의 transgenesis / recombineering ( 2) 끝 아웃 상동 재조합 (3) 게이트웨이 기술은 내생 게놈 유전자 좌를 조작하기위한 강력하고 효율적이며 유연한 방법을 제공합니다. 이 프로토콜에서는, 우리는 방법 (1) 디자인 individua에 대한 단계별 세부 사항을 제공L 벡터, (2) 간격 수리 (3) 방법 recombineering의 두 번째 라운드를 사용하여 이러한 벡터에서 관심의 유전자를 바꾸거나 태그를 사용하여 상동 재조합 벡터로 게놈 DNA의 큰 조각을 복제하는 방법에 대해 설명합니다. 마지막으로, 우리는 또한 녹아웃, 또는 노크의를 통해 태그 유전자를 생성하기 위해 생체 내에서 이러한 카세트를 동원하는 방법에 대한 프로토콜을 제공합니다. 이 방법은 쉽게 병렬로 여러 대상에 채택하고시의 적절하고 효율적인 방법으로 초파리의 게놈을 조작하기위한 수단을 제공 할 수 있습니다.
서론
자신의 내생 유전자 좌에서 단일 유전자의 분자 정의 된 조작을 청소하는 진핵 세포 생물학 관련 질문 수많은 연구에 귀중한 도구를 제공합니다. 초파리는 기능 상실 대립 유전자를 생성하는 유전자 기법을 역 Golić 선수와 동료에 도입 될 때까지 도전 할 수 입증했다 생체 내 유전자는 초파리 1-3에 상동 재조합을 사용하여 대상. 그들은 특정 게놈 유전자 좌가 통합 된 형질 전환 구조에서 DNA의 선형 조각을 사용하여 대상이 될 수 있습니다 보여 주었다. 이 선형 "기증자"DNA는 meganuclease I-SCEI와 선형화 다음 FRT-매개 재조합 (소비세에 원형의 분자와 같은 염색체에서 DNA)를 통해 생체 내에서 생성됩니다. 이 방법이 성공적으로 정의 된 병변의 다양한 생성하는 데 사용되었습니다 있지만, 기술은 병렬로 다수의 유전자의 조작에 쉽게 확장되지 않았기 때문에 각 indivi이중 녹아웃 구조는 독특하고 사용자 정의 디자인을 필요로합니다. 예를 들어, 완벽하게 고전적인 제한 효소 / 결찰 복제 또는 PCR뿐만 아니라, 생체 내 변환 벡터 전통의 크기 제한을 사용하여 체외에서 DNA (> 5 개 KB)의 큰 조각을 조작하는데 어려움은 종종 대상 상동 재....
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프로토콜
1. BAC의 선택하고 대상 지역
- 관심의 유전자 (GOI) (여기 CG32095가 예제로 사용)에서 CG32095 검색으로 BAC를 취득 www.flybase.org . 섹션 주식 및 시약에서 CG32095을 포함 세기관지은 "게놈 클론"이라는 섹션을 확인합니다. BAC 적어도 10킬로바이트 상류와 5킬로바이트 관심 하류 유전자가 포함되어 있는지 확인합니다. 또한, P [acman] 벡터 7 클론도에서 찾을 수 있습니다 http://www.pacmanfly.org/libraries.html .
- BAC 클론 DH10B 세포에 와서 P [acman] 클론 EPI300 세포에서 온다. 게놈 클론 recombineering에 대한 의무이다 SW102 세포로 변환해야합니다. "더러운 minipreps는"시작 (열을 사용하여 이소프로판올을 사용하여 DNA를 침전하지 않고 Qiagen의 miniprep) 수행5 ML O / N 문화 BAC를 포함하는 세포를 접종. dH보다 ....
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결과
LA와 RA 상동 팔의 증폭은 500 bp의 제품을 생산해야하며, PCR-SOE 반응은 1.0 KB 제품 (섹션 2.1-2.4; 그림 2) 산출해야한다. 2.5 절에서 수행 BP 반응은 일반적으로 제품의 수율 평균 5-100 식민지의 매우 효율적이고 세균의 변형이다. 거의 PCR로 테스트 한 모든 식민지는 예상 PCR 제품 표시를 선택하십시오.
recombineering의 첫 번째 라운드 (3 절) 동안 소화 P의 변환 후 20-40 식민지를 얻을 것으로 예상 [acman] SW102 세포로 LA와 RA 팔을 포함하는-KO-1.0. 이러한 클론 40-60 %가 원하는 재조합 제품을 수행한다. 모든 식민지가 같은 열 충격 세포에 비해 경우 비 열 충격 컨트롤은 거의 포함해야합니다. 샘플 및 제어 플레이트 모두 식민지의 같은 번호의 모양은 일반적으로 포경 플라스미드의 존재 또는 다른 오염 물질을 나타냅니다. 이 경우, 실험 수오LD는 삭제 및 반복,.......
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토론
생물 의학 연구에서 유전자 모델 생물의 힘은 크게 유전 조작을 위해 사용할 수있는 도구를 기반으로합니다. 작은 모델 C. 특히 엘레과 초파리는 다세포 개발이나 기능에 연루 전체 경로와 유전자 가족의 저렴하고 빠른 분자 유전 학적 분석을 허용합니다. 최근 몇 년 동안 초파리 14,15의 유전자를 조작하기위한 도구 개발에 상당한 진전을 보았다. 예를 들어, 널리 혈중 알코올 농도의 DNA 구조를 조작하는 마우스 유전학에서 사용되는 recombineering은 최근 P [acman] 벡터와 ΦC31 매개 transgenesis 6의 사용을 통해, 초파리에 맞게되었다. 다른 선택의 카세트 재조합 능력이 박테리아 4,13를 사용하여 구조 내의 아무 곳이나 특정 서열의 삽입 또는 삭제 할 수 있습니다. 우리가 수정 한 원래 P [acman]가 구성을 위해 사용할 수 있도록 벡터 초파리의
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공개 사항
저자는 여기에 설명 된 기술에 관해서 어떤 경쟁 이익을 가지고 있지 않습니다.
감사의 글
우리는 휴고 Bellen 및 시약 블루밍턴 증권 센터 감사의 말씀을 전합니다. 우리는 더 도움이 토론 공원 Venken, 휴고 Bellen 및 Buszczak 및 Hiesinger 연구소의 모든 구성원을 감사드립니다. 이 작품은 ACR에 건강의 국립 연구소 (T32GM083831), PRH (RO1EY018884)에서 교부금에 의해와 MB (RO1GM086647), MB와 PRH (RP100516)에 텍사스의 암 예방 연구소 부여, 그리고 웰치에 대한 지원 PRH에 기초 (I-1657). MB는 생물 의학 연구 및 PRH에서 전자와 그리어 GARSON Fogelson 학술 것은 UT 남서 의료 센터에 생물 의학 연구에 유진 맥 더못 학자이다.
....액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| SW102 재조합 가능 박테리아 | NCI-Frederick | 재조합 박테리아 (SW102, SW105 및 SW106) | http://ncifrederick.cancer.gov/research/brb/logon.aspx |
| TransforMax EPI300 electrocopmpetent E. coli | Epicentre | EC300110 | 포함 CopyControl 유도 용액 |
| PfuUltra II Fusion HS DNA 중합효소 | Aligent Technology Inc. | 600670 | |
| BamHI-HF | New England Biolabs | R3136S | |
| Zymoclean 젤 DNA 회수 키트 | Zymo Research | D4001 | |
| 사용 Gateway BP ClonaseII 효소 키트 | Invitrogen | 11789-020 | |
| P[acman]KO1.010 | Buszczak 및 Hiesinger Labs | 요청 | |
| pENTR RFP-Kan11 | Buszczak 및 Hiesinger Labs | Upon 플라이 | |
| 스탁 | 요청 블루밍턴 재고 센터 | 재고 번호: 25680, 25679 | y1 w*/Dp(2; Y)G, P{hs-hid}Y; P{70FLP}11 P{70I-SceI}2B snaSco/CyO, P{hs-hid}4 y1 w*/Dp(2; Y)G, P{hs-hid}Y; P{70FLP}23 P{70I-SceI}4A/TM3, P{hs-hid}14의 Sb1 |
| Electroporation 기계 | 165-2662 | 를 가진 Biorad GenePulser Xcell | |
| #FB101 |
참고문헌
- Rong, Y. S., Golic, K. G. A targeted gene knockout in Drosophila. Genetics. 157, 1307-1312 (2001).
- Rong, Y. S., Golic, K. G. Gene targeting by homologous recombination in Drosophila. Science. 288, 2013-2018 (2000).
- Gong, W. J., Golic, K. G.
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재인쇄 및 허가
