방법 논문

기능 모티브과 바인딩 파트너 펩타이드 기반의 식별

DOI:

10.3791/50362

⸱

2013년 6월 30일

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Microbiology, Biochemistry, & Immunology, Morehouse School of Medicine, 2Institute for Systems Biology, 3Advanced Medical & Dental Institute, Universiti Sains Malaysia

이 논문에서

요약

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exosomes에있는 HIV-1 Nef의의 분비를 기본 메커니즘을 해부하는 방법이 설명되어 있습니다. 네프 단백질 형질 전환에서 파생 된 특정 짧은 펩티드의 구조, 기능 및 네프의 분비 수정 지역의 바인딩 파트너를 결정하는 데 악용되었다. 이러한 절차는 많은 역학적 연구에서 일반적으로 관련이 있습니다.

초록

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우리의 경우 HIV-1 Nef의에, 전체 길이 단백질에서 발견 모티브에서 파생 된 특정 짧은 펩티드는 생물학적 기능을 유지뿐만 아니라, 경쟁의 전체 길이 단백질의 기능을 억제 할 수 있습니다뿐만 아니라. 20 네프 스캔 펩티드, 각 이웃의 10 아미노산 겹치는 길이 20 아미노산의 세트는 세포 사멸의 유도에 대한 책임 네프에서 모티브를 식별하는 데 사용되었다. 이러한 세포 사멸 주제를 포함하는 펩티드는 전체 길이 네프 단백질에 비해 수준에서 세포 사멸을 유도. 네프의 분비 수정 지역 (SMR)에서 파생 된 두 번째 펩티드, exosomes에있는 네프의 분비 (exNef)에 관련된 세포 단백질과 상호 작용하는 능력을 유지했다. 이 SMRwt 펩타이드는 네프의 SMR 주제에 구체적으로 바인딩 세포 단백질을 분리하기 위해 공동 immunoprecipitation의 실험에서 "미끼"단백질로 사용되었다. 단백질 형질 항체 억제는 물리적 상호 작용 내기를 중단하는 데 사용되었다싸우는 네프 및 mortalin, 고립 된 SMR-결합 단백질의 하나이며, 효과는 형광 기반의 exNef 분비 분석으로 측정 하였다. SMR 모티브를 결합 세포 단백질에 대한 전체 길이 네프을 outcompete하는 SMRwt 펩타이드의 능력은, 그것 exNef 분비의 첫 억제합니다. 따라서, 전체 길이 단백질에서 발견 모티브에서 파생 된 특정 짧은 펩티드의 고유 한 특성을 활용하여 여기에 설명 된 기술을 채용하여, 하나는 단백질의 기능 모티프의 식별 및 병원성 기능의 펩타이드 기반 억제제의 개발을 가속화 할 수 있습니다.

서론

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항 레트로 바이러스 치료의 도래와 함께, 서구 세계에서 에이즈 전염병이 둔화하지만, 축소하지 않으며, HIV의 확산은 전 세계에 걸쳐 중요한 건강 부담을 계속하고있다. 변두리에 효과적인 RV144 태국 재판을 제외하고, HIV 백신은 지금까지 감염으로부터 보호하기 위해 실패를 보여 주었다. 따라서, 추가, 잠재적 인 치료 표적에 대한 연구는 여전히 보증합니다.

CD4 T 세포 고갈과 함께, 지속적인 일반화 된 면역 활성화는 HIV 감염의 특징이다. 이 만성 면역 활성화 (CIA)은 세포의 매출 활성화와 차별화 된 림프 모집단, 휴대 피로와 노화, 및 활성화 유도 세포 죽음 (AICD) 1,2,3을 통해 T 세포와 B 세포의 살해의 증가로 연결하고, 그것은 잘 질병의 진행 4,5,6,7,8,9,10,11,12의 가장 강력한 예측 인자 중 하나로 설정됩니다. 그러나 메커니즘은 CIA와 CD4의 기초HIV 감염의 고갈 T-세포가 완전히 밝혀 할 수 남아 있습니다.

우리 실험실과 다른 사람의 증거는 HIV 단백질 네프는 (네거티브 규제 요인) HIV-1에 감염된 세포 13,14에서 exosomes에있는 그것의 분비를 유도 상기 질병의 진....

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프로토콜

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I.는 생물학적 분석에 짧은 펩티드의 사용

I.1. 펩티드를 사용하여 매핑 생물학적 기능 모티프

  1. 네프 스캔 펩티드와 세포 치료
    1. 관심 영역을 스캔 펩티드의 집합을 조달. 우리의 실험, 20mer 펩티드, 10 아미노산 중복와 함께, 전체 HIV-1 Nef의 단백질 (205 AA) 스패닝의 경우, 에이즈 시약 프로그램에서 하였다. 다음과 같은 펩티드는 개별적으로 assayed 있습니다 :
    2. 10 NG / 세포 배양 매체 펩타이드의 ML을 추가합니다.
    3. 세포 배양을 인 Jurkat가 접시 당 문화 매체의 10 ML을 추가합니다.
    4. 37 24 시간 동안 문화를 품어 ° C.
  2. 세포 사멸의 터미널 deoxynucleotidyltransferase - 중재 dUTP 비오틴 닉 엔드 라벨 ​​(TUNEL) 분석
    1. 1X PBS로 세포를 씻어 1X PBS, pH를 7.4에서 4 % 파라 포름 알데히드로 실온에서 30 분간 고정한다.
    2. 10 1X PBS로 세척하고, 0.1 %로 permeabilize 트리톤 X-100실온에서 분.
    3. 1X PBS로 두 번 세포를 씻어.
    4. 컴퓨터 제어 현....

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결과

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펩티드를 사용하여 생물학적 기능 모티프를 매핑. 두 개의 영역이 세포 사멸을 유도 네프 단백질에서 발견되었다. 펩타이드 기반의 세포 사멸은 N60 (aa40-60)과 N70 (AA50-70)에서 정점 및 펩타이드 N100 (aa80-100)에서 배경 수준으로 감소, 펩타이드 N50 (aa30-50)과 (그림 2) 처음 관찰되었다. AA50-60을 중심으로 주요 주제 1 (M1) 피크, 전체 길이 네프 단백질의 세포 사멸 수준의> 80 %를 유도합니다. 둘째, 작은 세포 사멸 피크 펩티드에게 N180 (aa160-180)과 N190을 (aa170-190)에 걸쳐 관찰되었다. aa170-180을 중심으로이 부 주제 2 (M2) 피크, 전체 길이 네프 단백질 16의 세포 사멸 레벨 ~ 30 %를 유도합니다.

경쟁 저해 분석 펩티드를 사용하여. 그림 3에서 그대로 SM.......

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토론

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exosomal 인신 매매 통로 exNef 분비 엔지니어링 소설 억제제에 도움이 될 것입니다 조작은 NEF의 능력을 기본 메커니즘을 이해. exNef 분비의 억제는 CD4 T 세포 고갈과 CIA 해당 드라이브 HIV / AIDS 발병을 감소해야한다. 이 목표를 향해, ​​우리는 우리가 exNef 분비의 유전학을 분석하고, 관련된 세포 단백질을 결정하기 시작 허락 소설 시약 및 방법론의 숫자를 개발했습니다. 이 방법은 직접 exNef 분비, SMRwt 펩타이드를 대상으로하는 최초의 억제제 개발했다.

우리의 작업의 주요 발견은 우리의 경우 전체 길이 단백질에서 발견 모티브에서 파생 된 특정 짧은 펩티드, HIV-1 Nef의, 생물학적 기능을 유지뿐만 아니라, 또한 경쟁의 전체 길이 단백질의 기능을 억제 할 수 있습니다. 이 펩티드는 생물학적 기능을 유지하기 때문에,이 기능 영역을 식별하는 데 사용할 수 있습니다전체 길이 단백질합니다. 두 가지가 필요합니다 : 그 단백질의 전체 길.......

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공개 사항

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저자는 그들이 더 경쟁 재정적 이익이 없다는 것을 선언합니다.

감사의 글

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이 작품은 NIH / NIGMS / MBR에 (그랜트 58268), NIH / NCRR / RCMI (부여 G12-RR03034), 조지아 리서치 얼라이언스 자금을 부여 GRA.VAC08.W, NIH / NIAID / NRSA 부여 F31AI091484, 모리 CFAR 교부금 P30에 의해 지원되었다 A1050409. 이 연구는 NIH / NCRR에서 연구 시설 개선 보조금 # C06 RR18386의 지원으로 건설 시설에서 실시되었다. 된 Jurkat 세포 20의 집합 HIV-1 Nef의 펩티드뿐만 아니라, 토끼 반대로 HIV-1 Nef의 항혈청은 NIH AIDS 연구 및 참조 시약 프로그램 (락빌, MD)에서 하였다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
10개의 아미노산이 겹치는 20mer 펩타이드 세트NIH AIDS 연구 및 참조 시약 프로그램4641
TUNEL 분석Roche11 684 809 910
Chariot 단백질 전달 시약활성 모티프30100
Tecan GENEios 형광측정기(Tecan Group, Switzerland)
96웰 블랙 마이크로타이터 플레이트코닝3792
anti-FLAG M2 Affinity GelSigmaA2220
Dynabeads Protein G 마그네틱 비드 Invitrogen100.03D
MagnaSphere Technology 마그네틱 분리 스탠드(2위치)Promega Corp., Madison, WIZ5332
C-18 ZipTip MilliporeZTC18S096C18 수지 (0.6 & l 또는 0.2 μ L 침대 볼륨). 올리고뉴클레오티드 또는 작은(< 50kDa) 수용액 내 단백질/펩타이드
MALDI TOF/TOF,Bruker Daltonics, ultraflex III, TOF/TOF

참고문헌

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Forsman, A., Weiss, R. A. Why is HIV a pathogen? Trends Microbiol. 16 (12), 555-560 (2008).
  2. Moir, S., Chun, T. W., Fauci, A. S. Pathogenic mechanisms of HIV disease. Annu. Rev. Pathol. 6, 223-248 (2011).
  3. Smith, S. M.

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Peptide ScanningApoptosis AssayCo immunoprecipitationFluorescent MicroscopyFlow CytometryHIV 1 NefSecretion Modification RegionExosome SecretionMortalin BindingPeptide Inhibitors

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