방법 논문

췌장의 베타 세포가 인슐린 분비에 영향을 미치는 세포 외 단백질 상호 작용의 배양 분석

DOI:

10.3791/50365

⸱

2013년 6월 15일

 ,  , 
1Pediatric Diabetes Research Center, University of California, San Diego, 2Janssen Research & Development, 3Department of Medicine, University of California, San Diego

이 논문에서

요약

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Transcellular 단백질 상호 작용은 췌장 베타 세포 기능의 중요한 결정 요인이다. 여기에 자세한 방법을 적응 특정 막 단백질은 인슐린 분비에 영향을 미치는 방법을 조사 시냅스 - 용의 배양 모델에서. 형질 HEK293 세포는 그 단백질을 표현, 베타 세포는 형질 전환하거나 직접 교란 할 필요가 없습니다.

초록

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세포 표면 단백질 사이의 상호 작용은 이웃 세포의 기능을 조정하는 데 도움이. 췌장 베타 세포는 췌장 내에서 함께 클러스터링과 포도당 항상성을 유지하기 위해 조정 방식으로 작동합니다. 그것은 인접 베타 세포의 표면에있는 막 단백질 사이의 상호 작용이 베타 세포 기능의 중요한 결정 요인임을 점점 더 분명 해지고있다.

배양 된 베타 세포 또는 생체 내에서 최저 녹아웃 또는 발현 연구에 의해 특정 transcellular 상호 작용의 역할의 해명은 잠재적 효과 분석을 혼동 수있는 방법으로 베타 세포의 건강 및 / 또는 기능에 영향을 미치는 발현 및 단백질 발현의 직접 섭동을 필요로 특정 상호 작용. 이러한 방법은 타겟 단백질의 세포 내 도메인 수준을 변경하고 표시 할 같은 세포막에서 단백질 사이의 상호 작용에 의한 영향을 방지 할 수 있습니다transcellular 상호 작용의 영향에서 tinguished.

여기에 베타 세포의 인슐린 분비 능력 및 응답의 특정 transcellular 상호 작용의 효과를 결정하기위한 방법이 제공됩니다. 이 방법은 INS-1 세포와 같은 베타 세포 라인에 그리고 해리 차 베타 세포에 적용 할 수 있습니다. 그것은 HEK293 (또는 COS) 시냅스 형성을 구동하기위한 중요한 세포층 확인 된 단백질의 발현 특정 신경 세포의 단백질 배양 신경 세포의 노출을 발견 신경 생물 학자에 의해 개발 된 배양 모델을 기반으로합니다. 시냅스의 베타 세포의 분비 기계 사이의 평행선을 감안할 때, 우리는 베타 세포 기능의 성숙 유사 transcellular 상호 작용에 의해 구동 될 수 있다는 추론. 우리는 베타 세포가 관심의 단백질을 발현하는 HEK293 세포의 레이어에 배양 시스템을 개발했다. 이 모델에서 베타 세포의 세포질은 그대로되어 세포 단백질 - 단백질 자원 활용하면서NS는 조작된다. 우리는 주로 포도당 자극 인슐린 분비의 연구에 여기에 초점을하지만, 다른 프로세스를 분석 할 수 있으며, 예를 들면, 유전자 발현의 변화로 immunoblotting을 또는 qPCR에 의해 결정됩니다.

서론

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우리는 여기에서 특정 막 단백질의 세포 외 도메인이 인슐린 분비에 영향을 미치는 방법 연구를 촉진하는 방법을 설명합니다. 췌장 베타 세포의 표면에 단백질 (또는 다른 분자)와 관심의 단백질의 상호 작용의 방법 프로브는 효과. 방법은 베타 세포 또는 다른 이웃 세포 ​​(예 : 내피 세포, 신경 세포, 췌장 알파 세포)에 의해 표현 세포 표면 단백질 transcellular 상호 작용 (즉, 인접한 표면에 상호 작용 파트너와의 상호 작용을 통해 통해 베타 세포 기능에 영향을 어떻게 조사 할 수 있습니다 베타 세포).

세포의 세포막은 세포 외 환경에 교량 역할을 구조적, 기능적 단백질의 복잡한 배열을 포함하고 있습니다. transcellular 연결의 형성에 의해 또는 플라스틱 신호 이벤트의 개시에 의해, 세포 표면 단백질 간의 상호 작용을 조정할 수 있습니다이웃 세포의 기능. 췌장 베타 세포는 췌장 내에서 함께 클러스터링과 포도당 항상성 1을 유지하기 위해 조정 방식으로 작동합니다. 로 세포 EphA-ephrinA과 포도당 자극 인슐린 분비의 조절에 neuroligin-2 상호 작용의 중요성에 의해, 예를 들어, 공개, 그것은 점점 더 분명 해지고있다 그 인접의 표면에 단백질 사이에서 발생....

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프로토콜

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1. HEK293 레이어의 형질 전환

  1. 50 ML FBS 5 ML 100X 페니실린 / 스트렙토 마이신 솔루션 5 ML 100X L-글루타민 용액 500 μL 암포 테리 신 : DMEM의 500 ML 병 (4.5 g / ML 포도당과 페놀 레드와 글루타민이없는)에 추가하여 HEK293 세포 매체를 준비합니다 B.
  2. 물론 당 HEK293 매체의 0.5 ML를 사용하여 24 - 웰 플레이트에 HEK293 세포 밖으로 접시. 세포가 플레이트의 하단에 균등하게 분산되어 있는지 확인합니다.
  3. HEK293 세포 플라스미드 lipofectamine과 프로토콜에 따라 관심의 단백질 (포유류 발현 벡터에 삽입) 및 lipofectamine과 2000 년 2 μl를 코딩의 0.8 μg으로 자랄 100 %, 형질에 도달합니다. 우리는 포유 동물 세포에서 발현을 위해 설계 pcDNA 3.3 백본을 사용하기로했다.
  4. 선택적으로, 배양 6 시간 후, 교환 형질 미디어 정상 HEK293 미디어 lipofectamine과 프로토콜 설명했다.
  5. 형질 전환 prote의 식을 계산하려면에 형질 전환 조직 문화 우물의 하위 집합을 표현 단백질의 면역 형광 검출 또는 표준 기술을 사용하여 단백질 발현의 서양 얼룩 분석에 사용할 수 있습니다.

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결과

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방법을 사용하여 여기에 설명 된, 우리는 인슐린 분비 단백질 neuroligin의 다른 변형의 효과를 시험했다. 이 베타 세포 기능 10 neuroligin-2의 효과를 조사하는 우리의 게시 된 작품을 보완한다. 그림 2 예를 들어, 여기에 언급 neuroligin 이소을 표현 형질 HEK293 세포 coculturing의 INS-1 베타 세포에서 얻은 결과를 보여 NL- X. 이 실험은 NL-X는 인슐린 분비를 증가시키는 transcellular 상호 작용에 종사하는 가설을 테스트하도록 설계되었습니다. 그림 2A, 그것은 NL-X의 발현이 기저 증가와 동시 배양 INS-1 세포에 의해 인슐린 분비를 자극 함을 알 수있다. HEK293 세포를 형질의 접근 방식은 그래서 그들은 NL-X를 표현하는 것을 우리는 그것이 세포 도메인 동시 배양 INS-1 세포, 즉 제공과 접촉 할 수 있으므로 HEK293 세포 표면에 표시되는 영역이며 것을 알 수 있습니.......

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토론

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여기에 설명 된 배양 방법은 특정 베타 세포 표면 막 단백질의 생리적 중요성을 확인하는 효과적인 방법을 제공합니다, 특히 자신의 세포 도메인으로. 세포 표면에 대한이자의 단백질을 표시하는 HEK293 세포와 접촉 배양 베타 세포 또는 인슐린 종 세포 (예 : 여기에 사용 된 INS-1 세포)에 의해 실험을 직접 방해하지 않고 세포 단백질 - 단백질 상호 작용의 효과를 결정하기 위하여 디자인 될 수있다 세포의 세포 내 환경. 관심의 단백질이 HEK293 세포에 의해 표현되기 때문에, 형질 전환 단백질의 세포 내 도메인에 의해 중재 될 수 β-세포 기능에 대한 영향은 없을 것입니다 따라서 세포 상호 작용의 효과 분석을 복잡하게하지 않을 것입니다.

인슐린 분비에 미치는 영향은 쉽게 HEK293 세포를 동시 배양 베타 세포에서 분비를 비교하여 확인할 수 있습니다제어 HEK293 세포와 접촉 동시 배양 베타 세포에서 분비 관심의 단백질을 표현. 제어 HEK293 세포는 모의 형질 전환.......

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공개 사항

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우리는 공개 아무것도 없어.

감사의 글

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이 작품은 건강 보조금 R01DK080971 및 청소년 당뇨병 연구 재단 보조금 37-2009-44의 국립 연구소에 의해 지원되었다. 우리는 UCSD 소아 당뇨병 연구 센터 (PDRC)로부터받은 지원도 주셔서 감사합니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
pcDNA 3.3 벡터/백본InvitrogenK830001
Lipofectamine 2000Invitrogen18324012
DMEMMediatech45001-312
펜/연쇄상구균 솔루션Mediatech45001-652-1
Amphotericin BMediatech45001-808-1/30
RPMI-1640Mediatech45001-404
D-PBSMediatech45001-434
나트륨 PyruvateMediatech45001-710-1
2-Mercapt– 탄올Invitrogen21985023
세포 스트리퍼Mediatech45000-668
T75 플라스크BD1368065
16% 파라포름알데히드전자 현미경 과학50980487
10x PBSMediatech45001-130
태아 소 혈청MediatechMT35010CV
IBMX시그마I5879-100MG
RIPA 용해 버퍼시그마R0278

참고문헌

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Kelly, C., McClenaghan, N. H., Flatt, P. R. Role of islet structure and cellular interactions in the control of insulin secretion. Islets. 3, 41-47 (2011).
  2. Konstantinova, I., et al. EphA-Ephrin-A-mediated beta cell communication regulates i....

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HEK293

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