우리의 개발 초기 단계에서 배아를 분리하는 효율적이고 간단한 방법을보고 애기 장대 씨앗. 최대 40 배아 다운 스트림 응용 프로그램에 따라 1 시간에서 4 시간으로 격리 할 수 있습니다. 절차는 DNA 메틸화, 리포터 유전자 발현, 면역 염색 및 형광 사체에 적합합니다 현장에서 교잡 분석.
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이 논문에서
요약
초록
배유 - - 임산부 씨 integuments (또는 종피)에 의해 둘러싸여 현화 식물에서 배아 영양 조직 내에서 개발하고 있습니다. 결과적으로, 초기 단계 (구상 단계 1 셀)에서 식물의 배아의 분리가 기술적으로 상대적인 어려움으로 인해 도전합니다. 초기 단계에서 효율적인 수동 박리 강력 젊은 애기 씨의 작은 크기와 주변 조직에 배아의 부착에 의해 손상된다. 여기, 우리는 다운 스트림 응용 프로그램에 따라 1 시간에서 4 시간 40 배아까지 항복, 젊은 애기 태아의 효율적인 분리를 허용하는 방법을 설명합니다. 배아는 약간 에펜 도르프 튜브에 플라스틱와 유 봉, 250-750 씨앗을 분쇄하여 분리 버퍼에 해제됩니다. 유리는 표준 실험실 피 펫 중 하나에 연결 microcapillary (고무 튜브를 통해) 또는 유압 제어 microinjector은 방울 곳에서 배아를 수집하는 데 사용됩니다거꾸로 광학 현미경에 다 잘 슬라이드 라. 필요한 전문 기술은 간단하고 쉽게 양도 할 수 있으며, 기본 설정 값 비싼 장비를 필요로하지 않습니다. 수집 된 배아는 RT-PCR, RNA 서열, DNA 메틸화 분석, 현장 하이브리드 화 (물고기)의 형광 면역 염색 및 리포터 유전자 분석과 같은 다운 스트림 응용 프로그램의 다양한 적합합니다.
서론
현화 식물의 배아는 배젖, 두 번째 수정 이벤트에서 파생 된 영양 조직으로 둘러싸여 있습니다. 모두 배아와 배유가 종피의 여러 세포 층에 의해 둘러싸여 있습니다. 종합적으로 이러한 조직은 과일 내부 개발 종자를 형성한다. 따라서, 조직 및 애기 장대 배아의 세포 별 분석은 강력하게 자신의 어려움으로 인해 손상됩니다. 그럼에도 불구하고, 늦은 구형 또는 이후 단계에서 배아는 비교적 잘 입체 현미경 하에서 미세 텅스텐 바늘을 사용하여 수동으로 해부 의무, 또는 그들을 추출하는 집게를 사용하여 초기에 약간의 압력을 적용하여 있습니다. 이러한 기술은 성공적으로 사체 또는 마이크로 어레이 하이브리드, 바이 설 파이트 시퀀싱, 또는 RNA 시퀀싱 (예 1-3)으로 epigenome 프로파일 분석에 사용 하였다. 반면, 초기 구상 단계에 수정란에서 배아의 연구는 기술적으로 도전 남아있다. 지금까지 몇 연구 담당자가고정 씨앗 섹션 4 좋은 도구 5를 사용하여 종자 내에서 개별 배아의 수동 추출에서 배아 조직 중 하나 레이저 캡처 microdissection을 (LCM)를 사용하여 젊은 배아 orted 사체 분석. 그러나 LCM 장비 초기 단계에서 일반적으로 사용되는 수동 배아 추출되지 않습니다 것은 시간이 쉽게 양....
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프로토콜
절차는 그림 1의 순서도에 요약되어 있습니다. microcapillaries과 악기 설정은 그림 2와 그림 3에 표시되고, 배아 분리의 일반적인 단계는 그림 4에 표시됩니다.
1. 재료 및 버퍼 준비
유리 microcapillaries 1.1 실리콘 코팅
- Sigmacote (시그마)의 ~ 5 ml의 15 ML 팔콘 튜브에 microcapillaries를 놓고 여러 번 반전.
- 용액을 제거, 60 ℃에서 알루미늄 호일에 모세 혈관을 포함 팔콘 튜브를 배치하고 3 시간을 위해 그들을 구울 상온에서 보관하십시오.
1.2 ~ 50-100 μm의 직경 microcapillary 정보를 얻을
- 수동 분젠 버너를 통해 또는 상용 풀러 (수직 필라멘트 끌어 당기는 사람 또는 micropipette의 풀러)를 사용하여 하나 1mm 직경의 유리 모세관을 당기십시오.
- 다이아몬드를 사용팁 펜이나 원하는 구멍을 만들 뽑아 모세관의 끝 부분을 잘라 블레이드. 스테레오 현미경 제일 모양의 모세 혈관을....
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결과
세척이 분자 응용 프로그램에 대한 예를 들어, 수행하는 경우에 우리의 배아 분리 절차 (그림 1) 4 시간 40 배아까지의 분리를 허용하거나, 시간 미만의 세척은 생략 세포 학적 응용 프로그램의 예 경우. 그림 2는 표시 높고 낮은 품질 microcapillary 팁과 그림 3은 배아 분리 시스템의 설정을 보여줍니다. 그림 4는 거꾸로 현미경에서 배아 분리의 과정을 표시합니다.
우리는 성공적으로 몇 가지 최근 기사에 게시 된 다양한 애플리케이션을위한 우리의 절차를 적용했다. 이 방법은 원래 초기 배아 사체에 대한 부모의 기여도를 분석하기 위해 개발되었다. 두 개의 서로 다른 애기 accessions (란츠 베르크 erecta (L 어)와 컬럼비아 (골-1)) 사이의 교차를 통해.......
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토론
우리는 효과적인 급속 배아 분리 프로토콜을 개발, 쉽게 다른 실험실로 전송 될 수 있습니다.
여기에 설명 된 장비는 거꾸로 현미경, 미세 조작기, 유리 microcapillaries, 수직 필라멘트 풀러와 microinjector (그림 3A)으로 구성되어 있습니다. 설치가 전사 체학 분석 17 한 동물 세포 분리에 대해 설명한 것과 비슷합니다. 우리는 또한 성공적으로 유리 microcapillaries를 수동으로 불꽃을 통해 늘어 (와 다이아몬드 블레이드로 절단) 대신 microinjector의 표준 실험실 피펫 (Pipetman P-200) (그림 3B)를 통해 운영 하였다보다 기본적인 설치를했습니다. 이 경우 microcapillary은 고무 튜브를 통해 피펫에 부착되었다. 10 μL filtertips은 그들을 밀폐하기 위해 파라 필름 (parafilm)으로 포장 된 접합을 만드는 데 사용.......
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공개 사항
저자는 그들이 더 경쟁 재정적 이익이 없다는 것을 선언합니다.
감사의 글
우리는 배아 분리에 대한 자신의 조언을 탈 Nawy 마틴 바이어에게 감사의 말씀을 전합니다. MTR, VG, UG와 CB는 배아 분리 장비를 고안했다. MTR, VG와 CB는 배아 분리 프로토콜을 개발했다. MTR, VG와 CB는 프로토콜을 확립 배아를 격리하고, 생성 된 배아의 cDNA, VG는 PCR, MTR GUS 염색, JJ 물고기 실험을 수행 하였다. MTR, VG, CG 및 UG는 원고를 썼다. 이 작품은 취리히 대학교, 로슈 연구 재단 (MTR까지)의 친목 및 스위스 국립 재단 (UG와 CB까지)에서 교부금에 의해 투자되었다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| REAGENTS | |||
| Sigmacote | SIGMA | SL2-100 ml | |
| RNAse OUT | Invitrogen (life technologies) | 10777-019 | |
| First- strand buffer | Invitrogen (life technologies) | 18064-022 | Superscript II 패키지에 포함 |
| DTT | Invitrogen (life technologies) | 18064-022 | Superscript II 패키지에 함유 |
| 혈청 알부민(BSA) 100x =10 mg/ml | New England Biolabs Inc. | 다른 공급업체들도 작업할 것입니다 | |
| . 얇은 벽 캡슐 1.0 mm | 세계 정밀 기기 | TW100F-4 | |
| DNA LoBind 튜브 0.5 ml | Vaudaux-Eppendorf | 0030108.035 | |
| CellTricsΔ 30 μ m | PARTEC | 04-0042-2316 | |
| 5웰 10mm 직경 슬라이드 | 전자 현미경 과학 | 63421-10 | |
| 포름알데히드 용액 | Sigma-Aldrich | F1635 | |
| Superfrost Plus 슬라이드 | Thermo Fisher | J1800AMNZ | Menzel-Glä ser |
| Tris | Amaresco | 0497 | |
| EDTA | Applichem | A2937 | |
| Glycin | Fluka | 50050 | |
| SDS 펠릿 | Roth | CN30.3 | |
| Micro Pestle | VWR | 431-0094 | |
| Microfine 인슐린 주사기 | BD | U-100 | |
| DEPC | Sigma-Aldrich | D5758 | |
| 에탄올 | Schaurlau | ET00102500 | |
| 집게 N5 | Dumont | 0108-5 | |
| 생물분석기 피코 칩 | Agilent Technologies | 5067-1513 | |
| EQUIPMENT | |||
| Inverted microscope | Nikon TMS (일본), | ||
| Micromanipulator | Leitz | 라이카 | |
| Micomanipulator 포스트 마운트 LH1 프로브 | Leica microsystems | 39430101 | 다른 브랜드도 작업을 수행합니다 |
| 수직 필라멘트 풀러 | Sutter 기기 | P-20 모델 | 다른 모델도 적합합니다 |
| Cell Tram vario | Vaudaux-Eppendorf | 5176.000.033 | |
| Bioanalyzer | Agilent Technologies | 2100 | |
| Qubit 형광측정기 | Invitrogen(생명 기술 |
참고문헌
- Gehring, M., Bubb, K. L., Henikoff, S. Extensive demethylation of repetitive elements during seed development underlies gene imprinting. Science. 324, 1447-1451 (2009).
- Muller, B., Sheen, J. Cytokinin and auxin interaction in root stem-cell s....
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