의 적용<em&gt; 체외</emDPS 단백질의 스트레스 중재 속성을 시각화&gt; DNA 보호 분석

요약

굶주린 세포 (DPS)에서 DNA-결합 단백질은 세균의 스트레스를 퇴치에 중요한 역할을한다. 이 문서의 정화에 대해 설명합니다 E. 대장균 공격력과에 대한 프로토콜 체외에서 분석은 활성 산소에 의해 분해로부터 DNA의 DPS - 중재 보호를 시연.

초록

산화 스트레스는 유산소 생활의 피할 수없는 부산물이다. 산소 분자 지상파 신진 대사를 위해 필수적이며,뿐만 아니라 살아있는 유기체 내의 많은 손상 반응에 참여합니다. 삶에 대한 또 다른 중요한 화합물이다 호기성 대사와 철의 결합은 펜톤 화학을 통해 래디 칼을 생산하고 세포 구성 요소를 분해하기 위해 충분하다. DNA 수리 멀리 사소한에서 그대로 DNA 저하, 틀림없이 세포 내 활성 산소를 포함하는 가장 유해한 프로세스입니다. 이 문서에서 제시된 분석은 급진적 인 매개 DNA 손상에 대한 분자와 효소의 효과를 측정하고 시각화하는 정량 기법을 제공합니다.

DNA 보호 분석은 단백질이나 화학 물질의 보호 속성의 체외 특성화, 간단한 빠르고 강력한 도구입니다. 그것은 손상 산화 반응에 DNA를 노출하고 그 화합물의 농도를 다양하게 추가 포함. 화합물의 농도의 함수로 DNA 손상의 감소 또는 증가는 다음 겔 전기 영동을 사용하여 시각화합니다. 이 문서에서 우리는 굶주린 세포 (DPS)에서 DNA-결합 단백질의 보호 특성을 측정하여 DNA 보호 분석의 기법을 보여줍니다. 공격력이 강력하게 환경 스트레스에 대처하기 위해 300 개 이상의 박테리아에 의해 이용되는 미니 페리틴입니다. 여기에서 우리는 DPS 정화 프로토콜과 DPS에 의해 DNA의 보호를 평가하기위한 최적의 분석 조건을 제시한다.

서론

호기성 생물은 끊임없이 자신의 DNA뿐만 아니라 다른 중요한 생물학적 거대 분자를 손상시킬 수있는 반응성 산소 종으로 주장해야합니다. 산화 손상의 독성을 중화하는 하나의 강력한 도구 굶주린 세포 (DPS)에서 DNA 결합 단백질이다. 굶주린 E.에서 1992 년 발견 이후 대장균 문화 ^1, 공격력이 박테리아와 archaebacteria ^2의 300 개 이상의 종에서 발견되었습니다. 정지 단계 동안 초당 엄청난 상향 조절은 E의 가장 높은 표현 핵 양체 - 관련 단백질을 만든다 기아 상태 ^{3, 4} 이하 대장균. 또한, DPS는 기아, 높은 철 농도, 자외선 노출, 열 충격 및 산화 스트레스 ^{5, 6을} (를) 포함하여 많은 다양한 스트레스 동안 세균의 생존과 DNA의 무결성을 모두 보존하기 위해 표시되었습니다.

12 단량체, w의 안정적인 호모 중합체 복합에 구조적, DPS는 자기 동료의 hich은 구형 빈 껍질로 조립합니다. ~ 4.5 nm의 넓은 내부 구멍은 작은 분자 ^(7)의 통과를 허용 모공을 통해 용매를 외부에 액세스 할 수 있습니다, 그것은 철 ^8과 같....

프로토콜

1. DPS 발현과 정제

높은 순도의 단백질을 얻기 DNA 보호 분석을위한 필수적인 첫 번째 단계입니다. DPS 단백질의 정제는 4 5 일에서 수행 할 수 있습니다.

1. E.의 단백질 분해 효소 결핍 긴장을 변환 DPS 단백질 인코딩 시퀀스가 복제 된 어떤에 애완 동물 벡터 (예 : pET17 등)와 대장균 (예 : BL21 (DE3) pLysS 등).
2. 킬 적절한 항생제 (예 : 1.1에서 제공하는 예제 암피실린 및 클로람페니콜 등)를 포함 루리아 국물 (LB) 한천 플레이트에 세포를 변형. 37에서 하룻밤 번호판을 품어 ° C.
3. 적절한 항생제를 포함하는 LB 매체의 30 ML에 플레이트에서 단일 콜로니를 접종한다. 37 밤새 품어 ° C 200 ~ 250 rpm으로 흔들어.
4. 10 ML 야간 문화의 각각 적절한 항생제를 포함하는 2 x 1 L의 LB 배지에 접종한다. OD _600에 떨고 동안 37 ° C에서 성장 약 0.6. (눈에 띄게 최종 제품의 순도를 손상시키지 않고, 더 높은 OD 증가 단백질 수율에 세포 성장을.) 0.3 mM의 농도로 IPTG 첨가하여 공격력의 발현을 유도하고, 흔들어 섞으면 서 3....

결과

여기에 설명 된 DPS의 정화 과정은 매우 재현. 설명 프로토콜에 따라 DPS 정화, E. 2 L을 사용하여 시작 지점으로 대장균 문화, 일반적으로 5, 12 μM 사이의 농도에서 ₁₂ 초당을 포함하는 단백질 2.5 mL를 얻을 것입니다. 긴 유도 회 (4 시간)이 변동성을 줄일 것으로 보인다. 단백질 순도는 SDS-PAGE 젤 (그림 1)에 의해 입증, 99 % 이상 일관되게됩니다. DNA 오염의 수준은 모두 DNA와 OD ₂₆₀ / OD ₂₈₀ 비율 스테인드 아가로 오스 젤에 의해 입증, 지속적으로 무시할 수 있습니다. 이 값은 다를 수 있지만, 값은 DNA의 오염 수준이 아니라 5 % 이하로 남아 있음을 나타내는 0.9 이상 결코 없습니다.

DNA 보호 분석의 결과의 재현성 실행에 크게 의존 할 것이다. 모든 성분의 농도를 정확하게 측정하는 경우 (특.......

토론

이 문서에 설명 된대로 공격력의 정화 과정은 매우 강력합니다. 순도는 지속적으로 (> 99 %) 고하고있다, 다른 단백질 보이는 밴드로 SDS-PAGE 젤에 표시되지 않습니다. DPS의 매우 높은 농도로 배양 할 때 부분적으로 DNA의 분해에 의해 입증 그럼에도 불구하고, 정제 된 DPS의 일부 일괄 처리, 핵산의 활동이 나타납니다. 이것은 우리가 정화를 통해 제거 할 수 없었던 낮은 농도에서 높은 활성 DNases의 존재를 나타낼 수 있습니다. 그러나,이 DNA의 분해는 일반적으로 체외 분석에 사용되지 않습니다 농도에서 관찰되므로 일반적으로 문제가되지 않습니다.

이 문서에 나와있는 DPS 정화 프로토콜은 몇 가지 장점이 있습니다. 단백질 선호도 태그가 될 필요가 없습니다, 기능을 방해 가능성이 존재하지 않도록. 정제 된 단백질은 DNA 무료이므로 체외 분석에서 DNA 결합 특성이 저하되지 않습니다 포함오염 가능성 아티팩트에서. 마지막으로.......

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
BL21(DE3)pLysS 유능 세포	Promega	L1195
pET-17b DNA	EMD-Millipore	69663-3
LB 육수 분말	시그마-알드리치	L3022
암피실린 나트륨 염	시그마-알드리치	A0166
클로람페니콜	시그마-알드리치	C0378
IPTG	시그마-알드리치	I6758
HEPES	BDH	441476L
수산화 칼	Merck	105033
염화나트륨	VWR	443824T
EDTA	시그마 - 알드리치	E9884
프로테아제 억제제 칵테일 세트 III	EMD-Millipore	539134
DEAE-Sepharose	시그마 - 알드리치	DFF100
황산 암모늄	시그마-알드리치	A4418
PD-10 탈염 컬럼	GE 헬스케어 LS	17-0851-01
SP-세파로스	시그마-알드리치	S1799
아미콘 울트라 센트. 필터 (10K MWCO)	Millipore	UFC901024
Ferrous Sulphate heptahydrate	Sigma-Aldrich	F8048
과산화수소 용액	Sigma-Aldrich	216763
MOPS	Calbiochem	475898
SDS 용액	Bio-Rad	161-0418
브롬화 에티듐	Sigma-Aldrich	E1510
정적 인큐베이터	Hettich	INE500
쉐이킹 인큐베이터	New Brunswick Sc.	Inova 44
냉각 원심분리기	Beckman Coulter	Avanti J-E
탁상용 원심분리기	Eppendorf	5424
Cell disrupter	Constant Systems Ltd.	TS2/40/AA/AA
FPLC 정수기	General Electric	AKTA
밀폐 바이알	Cole-Parmer	EW-08918-85
주사기 바늘	BD	305128
피펫	Eppendorf	Z683779-1EA, Z683795-1EA

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