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방법 논문

의 적용

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⸱

DOI:

10.3791/50390

⸱

2013년 5월 31일

 ,  , 
1Department of Bionanoscience, Kavli Institute of Nanoscience, Delft University of Technology

이 논문에서

요약

굶주린 세포 (DPS)에서 DNA-결합 단백질은 세균의 스트레스를 퇴치에 중요한 역할을한다. 이 문서의 정화에 대해 설명합니다 E. 대장균 공격력과에 대한 프로토콜 체외에서 분석은 활성 산소에 의해 분해로부터 DNA의 DPS - 중재 보호를 시연.

초록

산화 스트레스는 유산소 생활의 피할 수없는 부산물이다. 산소 분자 지상파 신진 대사를 위해 필수적이며,뿐만 아니라 살아있는 유기체 내의 많은 손상 반응에 참여합니다. 삶에 대한 또 다른 중요한 화합물이다 호기성 대사와 철의 결합은 펜톤 화학을 통해 래디 칼을 생산하고 세포 구성 요소를 분해하기 위해 충분하다. DNA 수리 멀리 사소한에서 그대로 DNA 저하, 틀림없이 세포 내 활성 산소를 포함하는 가장 유해한 프로세스입니다. 이 문서에서 제시된 분석은 급진적 인 매개 DNA 손상에 대한 분자와 효소의 효과를 측정하고 시각화하는 정량 기법을 제공합니다.

DNA 보호 분석은 단백질이나 화학 물질의 보호 속성의 체외 특성화, 간단한 빠르고 강력한 도구입니다. 그것은 손상 산화 반응에 DNA를 노출하고 그 화합물의 농도를 다양하게 추가 포함. 화합물의 농도의 함수로 DNA 손상의 감소 또는 증가는 다음 겔 전기 영동을 사용하여 시각화합니다. 이 문서에서 우리는 굶주린 세포 (DPS)에서 DNA-결합 단백질의 보호 특성을 측정하여 DNA 보호 분석의 기법을 보여줍니다. 공격력이 강력하게 환경 스트레스에 대처하기 위해 300 개 이상의 박테리아에 의해 이용되는 미니 페리틴입니다. 여기에서 우리는 DPS 정화 프로토콜과 DPS에 의해 DNA의 보호를 평가하기위한 최적의 분석 조건을 제시한다.

서론

호기성 생물은 끊임없이 자신의 DNA뿐만 아니라 다른 중요한 생물학적 거대 분자를 손상시킬 수있는 반응성 산소 종으로 주장해야합니다. 산화 손상의 독성을 중화하는 하나의 강력한 도구 굶주린 세포 (DPS)에서 DNA 결합 단백질이다. 굶주린 E.에서 1992 년 발견 이후 대장균 문화 1, 공격력이 박테리아와 archaebacteria 2의 300 개 이상의 종에서 발견되었습니다. 정지 단계 동안 초당 엄청난 상향 조절은 E의 가장 높은 표현 핵 양체 - 관련 단백질을 만든다 기아 상태 3, 4 이하 대장균. 또한, DPS는 기아, 높은 철 농도, 자외선 노출, 열 충격 및 산화 스트레스 5, 6을 (를) 포함하여 많은 다양한 스트레스 동안 세균의 생존과 DNA의 무결성을 모두 보존하기 위해 표시되었습니다.

12 단량체, w의 안정적인 호모 중합체 복합에 구조적, DPS는 자기 동료의 hich은 구형 빈 껍질로 조립합니다. ~ 4.5 nm의 넓은 내부 구멍은 작은 분자 (7)의 통과를 허용 모공을 통해 용매를 외부에 액세스 할 수 있습니다, 그것은 철 8과 같은 광물 금속을 격리 할 수 있습니다. DPS의 보호 효과가 아닌 특정 DNA 바인딩 1, ferroxidase 활동 및 철 저장 8 등의 여러 가지 생화학 적 활동에서 파생됩니다.

DPS의 유익한 생화학 활동의 자세한 연구는 먼저 정화가 필요합니다. DPS는뿐만 아니라 다른 단백질 분리뿐만 아니라, 바인드 된 DNA 7에서해야하므로 초당 정화는 정교한 절차입니다. 우리 최적의 정화 과정은 두 이온 교환 컬럼과 황산 암모늄 침전 단계로 구성된, 많은 일반적인 기술을 사용합니다. 고도로 집중된 공격력이 낮은 소금 조건에서 용액 침전 수있는 여러 버퍼 교환이 필요합니다. 일단 DPS 단백질은 정제 된, 그것은 직접 ferroxidase 활동 8, DNA-결합 양론 9, 철 결합 10의 메커니즘을 측정 분석에 적용 할 수 있습니다. 정제 DPS는 다른 잠재적 인 응용 프로그램이 있습니다. DPS의 안정 중공 구형 구조는 단백질 캐비티 내부 11 소수성 입자를 저장하기위한 발판으로 사용되어 반응 챔버 소설 자성 나노 입자에게 12 합성하는 것 같이.

활성 산소로 인한 손상을 중재하는 초당 공격력의 보호 능력은 명확해야하며 직접 DNA 보호 분석 13, 14을 사용하여 설명 할 수 있습니다. 철 펜튼 화학을 통해 H 2 O 2 분해를 촉진 할 때 체외 과정에서이, 라디칼이 생성됩니다. 이러한 활성 산소를 직접 반응에서 DNA 선물을 손상하고 완전하게 높은 농도를 저하시킬 수 있습니다. 두 가지 주요 DPS 활동은 직접 Fent의 효과를 방해 할 수 두에 매개 급진적 인 생산. DPS는 프로세스에 사용할 수있는 과산화수소를 소모 광물을 촉매 철의 농도를 낮춘다. 또한, DNA에 바인딩 초당 잠재적으로 유리기 손상으로부터 물리적으로 보호하고 덜 반응 표면적이 작은 볼륨으로 그것을 응축 수 있습니다. 이 두 속성의 조합은 잘 보호 DPS 활동을 측정하는 목적에 적합한 DNA 보호 분석을합니다.

DNA 보호 분석은 매우 다재다능하고 DPS 특성을 넘어 다양한 애플리케이션에 사용될 수 있습니다. 유리기 손상은 세포의 스트레스의 일반적인 형태이고, 많은 다른 단백질과 화학 물질을 중화하는 데 사용됩니다. 유리기 손상에 대한 마커로 DNA의 무결성을 사용하여 분석의 일반적인 원칙은 거의 모든 라디칼 생산 반응 또는 방해를 에이전트와 함께 사용할 수 있습니다. 다른 사람의 사이에서, 분석은 성공적으로 항산화 특성을 결정하는 데 사용되었습니다K.의 수산기 손상 중재 16 요산의 효과를 특성화하고, 모피 전사 조절 단백질 17의 기능에 새로운 통찰력을 얻기 위해 식품 산업 15에 사용의 paniculata 압축을 풉니 다.

발표 논문에서 분석의 다양한 사용에도 불구하고, 우리는 처음으로 많은 연구자에 대한 불필요 힘든 프로세스에 대한 분석을 설정하게되는 많은 최적화 및 문제 해결 단계가 필수 였을 것으로 나타났습니다. 우리는이 문서에서 제시 프로토콜 항목이 장벽을 제거하는 것을 목표로하고있다.

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프로토콜

1. DPS 발현과 정제

높은 순도의 단백질을 얻기 DNA 보호 분석을위한 필수적인 첫 번째 단계입니다. DPS 단백질의 정제는 4 5 일에서 수행 할 수 있습니다.

  1. E.의 단백질 분해 효소 결핍 긴장을 변환 DPS 단백질 인코딩 시퀀스가 복제 된 어떤에 애완 동물 벡터 (예 : pET17 등)와 대장균 (예 : BL21 (DE3) pLysS 등).
  2. 킬 적절한 항생제 (예 : 1.1에서 제공하는 예제 암피실린 및 클로람페니콜 등)를 포함 루리아 국물 (LB) 한천 플레이트에 세포를 변형. 37에서 하룻밤 번호판을 품어 ° C.
  3. 적절한 항생제를 포함하는 LB 매체의 30 ML에 플레이트에서 단일 콜로니를 접종한다. 37 밤새 품어 ° C 200 ~ 250 rpm으로 흔들어.
  4. 10 ML 야간 문화의 각각 적절한 항생제를 포함하는 2 x 1 L의 LB 배지에 접종한다. OD 600에 떨고 동안 37 ° C에서 성장 약 0.6. (눈에 띄게 최종 제품의 순도를 손상시키지 않고, 더 높은 OD 증가 단백질 수율에 세포 성장을.) 0.3 mM의 농도로 IPTG 첨가하여 공격력의 발현을 유도하고, 흔들어 섞으면 서 37 ° C 3 ~ 4 시간 동안 배양한다.
  5. 15 분 6,000 XG에서 원심 분리하여 수확 세포. 유도 세포 배양의 L 당 DEAE 버퍼 (50 MM의 HEPES - 코이, 산도 7.5, 100 MM의 염화나트륨, 0.1 mM의 EDTA) 7.5 ㎖에 세포 펠렛을 resuspend을. 샘플은 액체 질소에 냉동 원하는 경우, -80 ° C에 저장할 수 있습니다. 절차는 다음 4 ℃에서 물을 욕조에 샘플을 해동 계속 될 수있다
  6. 과발현 공격력의 저하를 방지하기 위해 세포 현탁액에 프로테아제 억제제 (예 : Calbiochem 세트 III 단백질 분해 효소 억제제로 세포 현탁액의 ML 당 0.167 μL)에서의 혼합물을 추가합니다.
  7. 프랑스 프레스를 사용하여 세포가없는 추출물을 준비합니다. 20 ML DEAE 버퍼 (연속 흐름 모델을 사용하는 경우), 다음 운영 중단과 총리는 프랑스 프레스t 20 KPSI 두 번 샘플. 불용성 입자를 명확히하기 위해 4 ° C에서 35 분 동안 30,000 XG에서 해물을 원심 분리기 및 뜨는을 저장합니다. 원하는 경우 상층 액을 한 후, 액체 질소를 사용하여 냉동 및 -80 ° C에 저장할 수 있습니다.
  8. FPLC를 사용하여 DEAE 버퍼와 함께 30 ML DEAE 세파 CL-6B 열을 평형. 배경 0.2 MPa의의 최대 압력으로 1-2 ML / 분에 열을 버퍼를 실행합니다. 칼럼에있는 셀이없는 추출물을로드하고 흐름을 통해 OD 280 신호가 기준보다 증가하기 시작 한 번 수집하기 시작합니다. DEAE 버퍼 열을 씻어 지속적으로 흐름을 통해 수집하는 동안 OD 280 값이 기준에 돌아올 때까지. 흐름을 통해 바인딩 된 DNA에서 무료로 DPS 단백질의 대부분을 포함해야합니다. 100 % 버퍼 B (50 MM의 HEPES - 코이, 산도 7.5, 1 M의 NaCl, 0.1 mM의 EDTA)로 컬럼을 씻으십시오. 이 용출액은 DPS-DNA 복합체뿐만 아니라 다른 단백질을 포함하고 삭제할 수 있습니다.
  9. 광고를 제거황산 암모늄 침전을 통해 단백질을 추가적인 오염. 풀링 흐름을 통해의 볼륨을 결정합니다. 천천히 (20 분 동안) 4시에 62 % 포화 (솔루션의 ML 당 390 밀리그램)에 ° C 잘 교반하면서 건조한 작은 입자 황산 암모늄을 추가합니다. 완전한 평형을 보장하기 위해 황산 암모늄의 마지막 부분을 추가 한 후 추가로 20 ~ 30 분 동안 혼합물을 저어. 오염 단백질 용액 침전 할 때 DPS는, 용해 상태로 유지됩니다.
  10. 4에서 30 분 동안 20,000 XG에서 원심 분리하여 침전 된 단백질을 제거 ° C 및 뜨는을 저장합니다.
  11. 천천히 94 % 포화에 도달하고 완전한 평형을 보장하기 위해 20-30 분 동안 저어 상등액의 ML 당 추가로 227 mg을 황산 암모늄을 추가합니다. 공격력이 높은 염 농도에서 침전, 4 ℃에서 30 분 동안 20,000 XG에서 원심 분리하여 수집 할 수 있습니다 DPS는 펠릿에있을 것이다 상층 액을 삭제할 수 있습니다. 펠렛은 -80 ° C에 저장할 수 있습니다 경우 데IRED.
  12. 부유 버퍼의 DPS 함유 펠렛을 (50 mM의 HEPES - 코이, 산도 7.5, 150 MM의 염화나트륨, 0.1 mM의 EDTA)를 Resuspend. 2.5 ML로 샘플 볼륨을 조정합니다.
  13. 버퍼 교환은 PD-10 겔 여과 칼럼을 사용하여 황산 암모늄을 제거합니다. 25 ML의 부유 버퍼에 젤 침대 평형. PD-10 열 상단에 DPS 샘플의 2.5 ML을 적용하고 흐름을 통해 폐기 안으로 흡수 할 수 있습니다. 3.5 ML의 부유 버퍼에 용출 DPS를 수집합니다.
  14. 4 10 분 16,000 XG에서 버퍼 교환 샘플을 원심 분리기 ° C 모든 불용성 구성 요소를 제거하고, 6-10 ML 희석 버퍼 (50 MM의 HEPES - 코이, 산도 7.5, 0.1 mM의 EDTA)로 희석을 보장하기 위해 그 소금 농도는 DPS가 SP 파로스 열에 바인딩 할 정도로 낮습니다. 초당 특히 농축 시료는 액체의 흐림에 의해 입증 낮은 소금 버퍼에 희석시 작 용해 될 수 있지만, 완전히 작은 amou의 추가에 의해 resolubilized 할 수 있습니다5 M 염화나트륨 용액 NT (추가 10-20 밀리미터).
  15. SP 버퍼 (50 MM의 HEPES - 코이, 산도 7.5, 50 MM의 염화나트륨, 0.1 mM의 EDTA)와 함께 30 ML SP 세파 빠른 흐름 열 평형. 1.5 ML / 배경 위에 0.3 MPa까지 압력 한계를 가진 분에 열을 버퍼를 실행합니다. 컬럼에 샘플을로드합니다. OD 280 추적이 반환 될 때까지 기준선에 SP 버퍼로 세척하고 흐름을 통해 폐기하십시오. 2 ㎖ 분수를 수집하는 동안, 0 100 % 버퍼 B에서 1​​50 ML 선형 그라데이션을 실행합니다. 10 % 변형이 가능하지만 공격력은 약 50 % B에서 날카로운 피크 용출된다.
  16. 15 % SDS-PAGE 젤에 용출 분획을 실행하고 분광 광도계를 사용하여 OD 260 / OD 280 비율을 측정하여 DNA의 오염을 확인합니다. 젤은 19 kDa의 주위에 하나의 밴드를 표시해야하며, OD 260 / OD 280 0.7 주위에 일반적이다. 순수한 DPS의 분수 수영장. 와 원심 필터 장치 (예 : Amicon 울트라 여과 장치)를 사용10K 분자량 컷 - 오프 초당 집중하고 저장 버퍼 (50 MM의 HEPES - 코이, 산도 7.5, 50 MM의 염화나트륨)로 교환합니다. -80에서 저장을위한 액체 질소에 분주은 정제 된 DPS 및 동결 ° C.

2. DNA 보호 분석

분석은 여러 시간에 민감한 단계를 포함하고 재현성 결과를 얻기 위해 두 번째로 초과해야한다. 다양한 재료와 피펫 단계가 포함되어 피펫 테이블 (표 1 참조) 단계와 볼륨을 추적하는 것이 좋습니다 때문에. 분석에 필요한 총 시간은 더 이상 3 시간입니다.

  1. 밀폐 유리 병에 30 ML 물을 측정, 용액으로부터 산소를 제거하는 10 분 (두 주사기 바늘, 액체의 한, 그 위에 하나를 사용하여)에 대한 N 2와 물을 세척하십시오. 2 밀리미터 주식 솔루션을 얻기 위해 물에 0.0168 g FeSO 4 • 7H 2 O를 추가합니다. 유리 병을 밀봉하고 혼합 한 후, 더 5 분 동안 질소로 세척하십시오. 해결책은해야합니다분명, 노란색의 힌트가 감지되면, 새로운 철 용액을 준비합니다.
  2. 얼음에 보관하고 알루미늄 호일에 싸서 빛으로부터 보호, H 2 O 2 용액 (1ml를 물에 9.2MH 2 O 2의 10.87 μL)이 100 밀리미터를 확인합니다. 자연 붕괴로 인해 준비 후 1-2 시간 동안 만 사용하십시오. 과산화수소 주식은 부분적으로 적절한 보관 (어둠 속에서, 4 ° C에서)에 의해 개량 할 수있다 고장에 유사하게 적용됩니다. OD 240을 측정하여 주식의 농도를 정기적으로 검사하는 것이 좋습니다.
  3. 상온의 물을 욕조에 빠르게 초당 정화의 나누어 지는를 해동, 얼음 계속. 침전 집계에 테이블 상단 picocentrifuge 4,000 XG에 10 초 동안 원심 분리기. 분광 광도계 (OD 280 = 1.547 100 μM 단량체 DPS의 농도를 나타낸다)를 사용하여 원심 분리 한 후 농도를 측정한다.
  4. 12X 반응 버퍼 (1을 사용하여 높은 농도 재고에서 선형 DNA를 희석μL / NG 100의 농도 M MOPS-KOH 산도 7.0, 1 M NaCl을). 선형 DNA를 정량보다 쉽게​​ 사용되지만, 플라스미드 DNA도 함께 사용할 수 있습니다.
  5. PCR 튜브에 DNA 버퍼 혼합물의 피펫 1 μL. 최종 반응 부피 (마이너스 SDS)은 12 μL 될 수 있도록 반응에 충분한 물을 추가합니다. 이 금액은 피펫 테이블을 사용하여 사전에 계산되어야한다. 3 μM의 최종 dodecamer 농도에 DPS를 추가합니다. DPS는 DNA에 결합 할 수 있도록 실온에서 15 분 알을 품다.
  6. 원하는 농도에 도달하는 2 개 mm FeSO 4 용액을 추가합니다. 전형적인 실험은 0에서 1 mM의 FeSO 4 농도의 범위를 사용합니다. 높은 농도는 더 광범위한 DNA 저하의 원인이됩니다뿐만 아니라 철은 반응 혼합물에 침전물의 형성으로 이어질 수 있습니다. 빨리 100 개 mm H 2 O 2 용액 (10 mM의 최종 농도) 1 μl를 추가하고, 펜톤 수 있도록, 5 분 실온에서 알을 품다자리를 차지할 매개 분해 반응.
  7. 20 % SDS (나트륨 도데 실 황산)의 0.8 μl를 추가합니다. 혼합 DPS-DNA 복합체를 방해하는 5 분 동안 85 ° C에서 알을 품다. SDS는 DPS-DNA 복합체를 불안정하게하고 정량의 용이성을 향상 DNA, 원치 않는 젤 변화를 방지 할 수 있습니다. 선택적 단계는 무독성 제품으로 촉매 분해 과산화수소로 반응을 중지하는 것입니다. 이 프로토콜에 설명 된 조건이 단계는 DNA 저하의 넓은 범위를 얻기 위해 필요하지 않습니다.
  8. 염료를로드 추가 1 분 동안 얼음에 품어와 아가로 오스 겔에로드합니다. 젤을 실행하고 ethidium의 브로마이드를 사용하여 DNA를 얼룩. 젤은 젤 ethidium의 브로마이드 유통을 방해 SDS를 방지하기 위해 사후 전기 스테인드보다는 전기 이전에해야한다.

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결과

여기에 설명 된 DPS의 정화 과정은 매우 재현. 설명 프로토콜에 따라 DPS 정화, E. 2 L을 사용하여 시작 지점으로 대장균 문화, 일반적으로 5, 12 μM 사이의 농도에서 12 초당을 포함하는 단백질 2.5 mL를 얻을 것입니다. 긴 유도 회 (4 시간)이 변동성을 줄일 것으로 보인다. 단백질 순도는 SDS-PAGE 젤 (그림 1)에 의해 입증, 99 % 이상 일관되게됩니다. DNA 오염의 수준은 모두 DNA와 OD 260 / OD 280 비율 스테인드 아가로 오스 젤에 의해 입증, 지속적으로 무시할 수 있습니다. 이 값은 다를 수 있지만, 값은 DNA의 오염 수준이 아니라 5 % 이하로 남아 있음을 나타내는 0.9 이상 결코 없습니다.

DNA 보호 분석의 결과의 재현성 실행에 크게 의존 할 것이다. 모든 성분의 농도를 정확하게 측정하는 경우 (특...

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토론

이 문서에 설명 된대로 공격력의 정화 과정은 매우 강력합니다. 순도는 지속적으로 (> 99 %) 고하고있다, 다른 단백질 보이는 밴드로 SDS-PAGE 젤에 표시되지 않습니다. DPS의 매우 높은 농도로 배양 할 때 부분적으로 DNA의 분해에 의해 입증 그럼에도 불구하고, 정제 된 DPS의 일부 일괄 처리, 핵산의 활동이 나타납니다. 이것은 우리가 정화를 통해 제거 할 수 없었던 낮은 농도에서 높은 활성 DNases의 존재를 나타낼 수 있습니다. 그러나,이 DNA의 분해는 일반적으로 체외 분석에 사용되지 않습니다 농도에서 관찰되므로 일반적으로 문제가되지 않습니다.

이 문서에 나와있는 DPS 정화 프로토콜은 몇 가지 장점이 있습니다. 단백질 선호도 태그가 될 필요가 없습니다, 기능을 방해 가능성이 존재하지 않도록. 정제 된 단백질은 DNA 무료이므로 체외 분석에서 DNA 결합 특성이 저하되지 않습니다 포함오염 가능성 아티팩트에서. 마지막으로...

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공개 사항

우리는 공개 아무것도 없어.

감사의 글

우리는 미카엘라 데 마르티노, 윌프레드 R. 하겐, 유용한 토론 Kourosh Honarmand Ebrahimi에 감사합니다. 이 작품은 기술의 델프트 대학에서 기금을 시작으로 지원되었다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
BL21(DE3)pLysS 유능 세포PromegaL1195
pET-17b DNAEMD-Millipore69663-3
LB 육수 분말시그마-알드리치L3022
암피실린 나트륨 염시그마-알드리치A0166
클로람페니콜시그마-알드리치C0378
IPTG시그마-알드리치I6758
HEPESBDH441476L
수산화 칼Merck105033
염화나트륨VWR443824T
EDTA시그마 - 알드리치E9884
프로테아제 억제제 칵테일 세트 IIIEMD-Millipore539134
DEAE-Sepharose시그마 - 알드리치DFF100
황산 암모늄시그마-알드리치A4418
PD-10 탈염 컬럼GE 헬스케어 LS17-0851-01
SP-세파로스시그마-알드리치S1799
아미콘 울트라 센트. 필터 (10K MWCO)MilliporeUFC901024
Ferrous Sulphate heptahydrateSigma-AldrichF8048
과산화수소 용액Sigma-Aldrich216763
MOPSCalbiochem475898
SDS 용액Bio-Rad161-0418
브롬화 에티듐Sigma-AldrichE1510
정적 인큐베이터HettichINE500
쉐이킹 인큐베이터 New Brunswick Sc.Inova 44
냉각 원심분리기Beckman CoulterAvanti J-E
탁상용 원심분리기Eppendorf5424
Cell disrupterConstant Systems Ltd.TS2/40/AA/AA
FPLC 정수기General ElectricAKTA
밀폐 바이알Cole-ParmerEW-08918-85
주사기 바늘BD305128
피펫EppendorfZ683779-1EA, Z683795-1EA
륨

참고문헌

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  17. Lopez-Gomollon, S., Sevilla, E., Bes, M. T., Peleato, M. L., Fillat, M. F. New insights into the role of Fur proteins: FurB (All2473) from Anabaena protects DNA and increases cell survival under oxidative stress. The Biochemical Journal. 418 (1), 201-207 (2009).
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