호스트 병원체 단백질 - 단백질 상호 작용의 풍경의 특성을 비교 접근

요약

이 문서에서는 호스트와 두 개의 직교 방법의 조합을 사용 병원균의 단백질 사이의 높은 자신감 상호 작용 집합의 식별에 초점을 맞추고 효모 두 하이브리드 HT-GPCA이라는 포유 동물 세포에서 높은 처리량의 상호 작용 분석에 의해 따랐다.

초록

상당한 노력은 대규모의 종합 단백질 - 단백질 상호 작용 네트워크의지도를 생성하기 위해 모였다. 이 병원체 호스트 관계를 이해하는 수단이며, 본질적으로 효모 두 하이브리드 시스템을 유전 검사에 의해 수행되었다. Gaussia 루시 페라 기반의 파편 보완 분석에 의한 단백질 - 단백질 상호 작용 검출의 최근 개선은 이제 엄격 세포 요소의 공통 집합에 대해 서로 다른 병원체 변형 변종 단백질의 상호 작용 프로파일을 비교하기 위해 필요한 통합 비교 interactomic 방법을 개발하는 기회를 제공합니다.

이 논문은 특히 단백질 - 단백질 상호 작용 데이터 세트를 생성하는 두 개의 직교 방법을 결합하는 유틸리티에 초점을 맞추고 효모 두 하이브리드 (Y2H)과 새로운 분석, 포유 동물 세포에서 수행 높은 처리량 Gaussia 프린 단백질 보완 분석 (HT-GPCA). NT는 "병원체 단백질의 세포 파트너>의 대규모 식별은 여러 병원체 변형 변형을 사용하여 cDNA를 라이브러리의 두 하이브리드 상영 짝짓기 기반 효모에 의해 수행됩니다. 높은 신뢰도 통계 득점에서 선택한 상호 작용하는 파트너의 하위 집합이 더 있습니다 HT-GPCA을 사용 병원균의 변종 단백질의 전체 세트와 짝 상호 작용 포유 동물 세포에 확인. 두 개의 보완적인 방법이 조합은 상호 작용 데이터 집합의 견고성을 향상하고, 엄격한 비교의 상호 작용 분석의 성능을 할 수 있습니다. 이러한 비교 interactomics은 해독하는 병원체 호스트 interplays에 신뢰할 수있는 강력한 전략을 구성합니다.

서론

단백질 - 단백질 상호 작용지도를 생성하기 위해 수집 된 데이터의 양이 증가 더욱 병원체 감염을 이해하는 관점을 엽니 다. 병원균 감염의 글로벌 이해가 등장하기 시작, 그것은 인간 프로테옴 ¹ 연결할 때 병원균의 단백질에 의해 유도 교란의 범위에 대한 액세스를 제공합니다. 그것은 따라서 병원균이 숙주 세포의 기계를 조작하는 방법을 이해하는 방법을 제공합니다. 특히, 여러 가지 바이러스 호스트 상호 작용 네트워크의 매핑은 바이러스 성 단백질이 우선적으로 고 (허브) 셀룰러 네트워크에 연결되어 있거나 네트워크 (병목 단백질) ^2-4 여러 경로의 중심되는 호스트 단백질을 표적으로 나타났습니다. 이러한 상호 작용은 전염성 자손을 복제하고 생산 수단이되는 바이러스는 중요한 세포 프로세스를 조작 할 수 있습니다. 비교 상호 작용을 매핑은 최근을 기준으로 정보를 추출하는 것을 목표로 관련 바이러스에 실시되었다발병 ^4. 또한, 호스트 병원체 상호 작용 풍경의 연구는 많은 병원체 ⁵ 확장되었습니다. 대상 셀 요인 식별 세포를 감염하는 병원체에 의해 사용되는 전략에 대한 통찰력을 제공하고 잠재적 인 병원성 마커를 감지 할 수 있습니다.

효모 두 하이브리드 시스템은 유전자 검사는 ....

프로토콜

1. 효모 두 하이브리드 스크리닝

1. 다음의 필수 솔루션을 만들기 :
   1. 완전한 합성 드롭 아웃 (SD)는 : 물 1 L의 포도당 최소 SD베이스의 26.7 g을 용해. 다음과 같이 준비 아미노산 혼합물 2g을 추가 2g 아데닌 hemisulfate, 2g 아르기닌 HCL에, 2g 히스티딘 염산, 2g 이소류신, 4g 류신, 2g 리진 염산, 2g 메티오닌, 3g 페닐알라닌, 2g L -세린, 2g L-트레오닌, 트립토판 3g, 2g 티로신 1.2 g 우라실, 9g 발린.
   2. SD-L/-W/-H 아웃 선택 드롭 : SD가 그 지정된 제외한 모든 필수 아미노산을 포함하는 (-L :-류신,-W :-트립토판,-H :-히스티딘).
   3. YPGLU : 1 L, 무게 효모 추출물, Bacto 펩톤 10 g와 포도당 20g의 10g하십시오. 고체 미디어 25g Bacto 한천로 작성합니다.
   4. YCM : YPGLU과 동일하지만, pH를 4.5로 조정.
2. 짝짓기 및 확산
   1. 사전 변환 냉동 분주을 사용하여pACT2에서 복제 된 cDNA의 라이브러리를 포함 ED Y187 효모 균주 (연결 타입 α). ....

결과

그림 2의 HPV E2 단백질 (참고 13 일부터 적용)에 대한 거짓 긍정과 거짓 부정 비율의 평가에 의해 그림과 같이 HT-GPCA의 주요 장점은, 높은 감도에있다. 음성률을 확인하려면, HPV16에서 E2의 알려진 상호 작용은 HT-GPCA (그림 2A)에 의해 평가 하였다. 18의 상​​호 작용 중 네 가지가 (22 % 위음성 율에 해당) 복구되지 않았다. 거짓 긍정적 인 상호 작용은 세포 단백질의 임의의 집합 (그림 2B)에 12 HPV E2 단백질을 사용하여 5.8 %로 측정되었다. 또한, 메소드의 강한 특이 E2는 세포 파트너 BRD4에 바인딩을 방해하는 것으로 알려져 단일 지점 돌연변이 NLR 비율 (그림 2C)를 전멸 것을 보여주는 그림 2C으로 강조 표시됩니다.

이 대규모 비교 interactomic 접근 방식.......

토론

독립적으로, 효모 이러한 두 GST 풀다운 Lumier의 또는 MAPPIT으로 하이브리드 및 포유류의 상호 작용 분석은 단백질 - 단백질 상호 작용을 검출하는 효과적인 도구로 입증했지만, 양성과 거짓 음성의 높은 속도에 의해 제한됩니다 상호 작용은 이러한 기술 ^15과 관련된. 또한, 증거가 직교 방법을 결합하여 얻어진 상호 작용 데이터 세트 ^7의 신뢰성을 증가 시킨다는 성장하고있다. HT-GPCA 기술의 최근 발전은 포유 동물 세포에서 진 단백질 - 단백질 상호 작용을 검출 감도를 향상되었습니다뿐만 아니라 한 번에 상호 작용의 많은 양을 처리 할 수​​있는 가능성을 제공하고 여기에 설명.

여기에 설명 된 전략은 여러 변형 변형의 상호 작용을 프로빙하여 개별 Y2H 검진의 범위를 향상시킵니다. 또한, 직교 검출 방법으로 상호 작용을 다시 테스트하는 엄격한 비교 상호 작용을 제공합니다한계를 극복하고 두 하이브리드 방식에 내재 유물을 탈출하여.......

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
효모 균주	Clontech
Minimal SD base	US biological	D9500
Amino acids	Sigma
3-amino-1,2,4-Triazole (3-AT)	Acros organics	264571000
Zymolase	Seikagaku	120491
DMEM	Gibco-Life Technologies	31966
소 태아 혈청	BioWest	S1810
인산염 완충액 식염수(PBS)	Gibco-Life Technologies	14190
페니실린-스트렙토마이신	Gibco-Life Technologies	15140
Trypsin-EDTA	Gibco-Life Technologies	25300
Renilla luciferase assay	Promega	E2820
White 배양 플레이트	Greiner Bio-One	655083
96-wellPCR 플레이트	4titude	4t-i0730/C
인큐베이터 (30 ° C)	Memmert
인큐베이터 (37 ° C)	헤레우스
광도계	Berthold	Centro XS-LB 960