방법 논문

마우스의 유전자 조작을 통해 시상 하부 개발 자궁 내 일렉트로

DOI:

10.3791/50412

⸱

2013년 7월 24일

 ,  ,  , 
1Institute of Anatomy and Cell Biology, University of Heidelberg , 2Institut de recherches cliniques de Montreal

* These authors contributed equally

이 논문에서

요약

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시상 하부의 기능 및 의료 중요성에도 불구하고, 자궁 내 유전자 조작은 거의 시도되지 않았습니다. 우리는 당신을위한 자세한 절차를 보여 자궁 내 일렉트로.

초록

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개발 포유류 뇌의 특정 영역의 유전자 변형은 매우 강력한 실험적인 방법입니다. 그러나 새로운 마우스 돌연변이를 생성하는 것은 종종 절망적 느립니다. 그것은 합리적인 포스트 치료실 생존 자궁에서 발전 마우스 뇌에 액세스 할 수 있습니다 것으로 나타났습니다. 하지만이 절차의 결과가 두뇌 개발의 가장 피상적 쉽게 접근 할 부분에 거의 독점적으로보고되었습니다 피질 즉. 시상, 좁은보다 중간 지역은, 대상에 대한 더 어려운 입증되었습니다. 특히 깊은 핵, 시상 하부의 사람들로 형질은 가장 도전하기 때문에 거의 결과가보고되었다 아마도. 여기에서 우리는 전체 시상 하부 neuroepithelium 또는 electroporation을 통해 형질 전환을위한 그것의 일부를 (시상 하부 지역) 대상으로하는 절차를 보여줍니다. 우리의 접근에 키는 t의 긴 마취 시간, 주입하다HIRD 뇌실, 적절한 종류와 전극의 위치. 또한, 우리는 대상과 가장 오목한 시상 하부 핵, mammillary 몸의 후속 조직 학적 분석 결과를 보여줍니다.

서론

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배아 마우스 뇌의 유전자 조작은 개발 규제에 대해 배울 수있는 바람직한 방법입니다. 돌연변이 마우스 라인의 세대는 그러나 느리고 비싸다. 포유류의 뇌의 뉴런을 개발 특정 유전자 변화를 소개하는 하나의 강력한 방법은 자궁의 electroporation에 있습니다. 기본적으로, 기술은 그 배아는 일정 시간 동안 생존 뇌를 수집하고 가능한 한 소설, 정보 표현형을 위해 그 (것)들을 검사 할 수있는 전기 펄스에 의해 배아 뇌 neuroepithelium에 DNA를 형질로 구성되어 있습니다. 이러한 방법으로, 실험 마우스 돌연변이의 생산에 필요한 긴 대기 기간없이 즉시 가설을 테스트 할 수 있습니다.

개발 배아에 DNA의 형질 전환 병아리 배아 1 비켜 electroporation을에 시작했다. 마우스 증명 (proof-of-concept) 필수는 문화에 수행 된 까지. 이것은 곧 자궁 3,4에서 마우스 기술의 첫 번째 설명으로 이어졌습니다.

주요 문제는 그 (것)들 또는 어머니를 죽이지 않고 자궁에서 개발 태아의 두뇌를 형질하는 것입니다. (개복술, 사출, 일렉트로) 필요한 수술을 배....

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프로토콜

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1. 주사 DNA 유리 마이크로 피펫의 준비

  1. 좋은 품질의 유리 마이크로 피펫은 양수의 손실로 인해 초기 높은 낙태 비율을 줄이기 위해 필수적입니다. 유리 마이크로 피펫을 당겨하는 절차가 잘 13,18,25를 기록하고있다. 열 = 300; 1.2 mm 직경의 모세관을 사용하여 설정 P = 500와 기존의 셔터에 P-97 장치를 뽑아 = 40을 당겨 속도 = 50; 시간 = 50. 3mm "구유"필라멘트 (셔터 악기 FT330B)와 풀러 맞 춥니 다. 2mm 크기의 필라멘트는 우리 덜 만족스러운 결과를 굴복했다. 한편, 마이크로 피펫 팁의 경사지는 것은 우리에 대한 결과를 개선하지 않는 것.
  2. 1 ~ 2 ㎍ / μL의 최종 농도에 녹색 빠른 0.1 %를 포함하는 PBS의 정화, 독소 무료 플라스미드 DNA를 (세포 배양 학년) 녹입니다. 빠른 그린은 배아 뇌의 뇌실에서 볼 수 주입 솔루션을 만들 것입니다.
  3. 유리 micropipette를에 DNA 용액 10 μl를로드합니다.
  4. 분사 시스템 (피코 펌프)이나 입 피펫에 유리 micropipette를 연결합니다.

2. 마취

가열 패드와 수술기구와 수술....

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결과

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대부분의 시상 하부 뉴런은 다소 짧아 마우스 개발 27,28로 번역 쥐 26 출생 연대 분석에 따르면, E11.5 사이 E15.2에 태어난다. 시상 하부 신경의 피크 E12.5 29-31에 도달합니다. 따라서, 본 연구 (E12.5)에 대해 선택된 형질의 나이에, 시상 하부 뉴런의 큰 비율은 주어진 rostro - 꼬리 수준에서 표시 할 수 있습니다.

두꺼운 vibratome 유형 섹션에 E18.5에서 분석 (그림 3A 및 3B) 시상 하부 neuroepithelium의 전체 rostro - 꼬리 확장 일렉트로 (그림 3A)에 액세스 할 수 있는지 보여줍니다. 특정 나이에, 뉴런 계보 연구 32과 일치, 모든 메디 - 측면 수준 (그림 3B)에서 표시 할 수 있습니다. mammi.......

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토론

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마취 소개 : 시상 하부에 자궁의 electroporation 기술적으로 험난 할과 긴 마취 시간을 필요로 할 수 있기 때문에, 우리는 산소와 isoflurane을의 혼합물의 관리를 통해 마취를 유도하고 유지하는 것을 선호합니다. 우리의 경험에서, 동물, 적어도 어머니의 회복이 매우 빠르고, 배아 생존율이 향상 1 시간까지의 기간 동안이 방법으로 적절한 마취 남아있을 수 있습니다. 마취 다른 방법도 사용할 수 있습니다. 가장 간단한 절차를 복강 내 주사하여 마취를 유도하고 유지 관리하는 구성 2.5 0.9 밀리리터 / 케타민 (25 밀리그램 / ML), Xylazin (1.2 ㎎ / ㎖) Acepromazin (0.35 밀리그램 / ML)의 혼합물 체중 kg % 멸균 염화나트륨 ( "트리플 콤보"). 혼자 혼합물로, 여기에서 권장 용량에서 약 30 분 (일부의 경우 최대 45 분)의 마취가 유도된다. 이것은 일반적으로 충분한 E12.5에서 피질로 자궁의 electropo.......

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공개 사항

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저자는 그들이 더 경쟁 재정적 이익이 없다는 것을 선언합니다.

감사의 글

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이 작품은 독일 연구 재단 (도이치 Forschungsgemeinschaft)에 의해 재정 지원되었다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
 REAGENTS
AcepromazineSanofi GmbH마취제
IsofluraneBaxterHDG9623마취제
KetaminPharma GmbH마취제
Fast GreenFluka44715 
RimadylPfizer비스테로이드성 항염증제
Braunoderm Braun3887138포비돈-요오드
인산염 완충액 식염수 PBSGibco14190 
Temgesic (buprenorphine)Essex Pharma오피오이드 진통제
눈 연고Pan-Ophtal7136926 
자일라진바이엘 
 EQUIPMENT
Anaesthetic Device Komesaroff Mark-5Medical Developments AustraliaACN 004 903 682 
모세관 끌어당기는 사람 P-97Sutter Instrument Co.P-97 
CompresstomePrecisionary Instr.VF-300진동형 장치
컨포칼 현미경ZeissLSM700 
저온 유지 장치라이카CM3050S 
ElectroporatorNepa Gene Co. Ltd. (전기천공기 Nepa Gene Co., Ltd.)CUY21EDIT 
전극 1Nepa Gene Co., Ltd.CUY550-10스테인레스 스틸 바늘 전극, 10mm 팁, 0. 5mm 직경.
전극 2Nepa Gene Co., Ltd.CUY700P4L커버 라운드 플래티넘 플레이트 4 mm 직경
광섬유 콜드 라이트 소스LeicaKL2500 LCD 
유리 모세관Harvard ApparatusGC120T-151. 2mm O.D. x 0. 94mm I.D.
유리 구슬 살균기파인 사이언스 툴FST250 
히팅 패드하버드 장치py872-5272 
주입 장치세계 정밀 기기공압 피코 펌프 PV820 
봉합사 코팅 VicrylEthiconV4914복막 봉합
Thr. SupramidSerag WiessnerTO07171L피부 봉합사
사 봉합사

참고문헌

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Itasaki, N., Bel-Vialar, S., Krumlauf, R. Shocking' developments in chick embryology: electroporation and in ovo gene expression. Nat. Cell Biol. 1, E203-E207 (1999).
  2. Miyasaka, N., Arimatsu, Y., Takiguchihayashi, K. Foreign gene....

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In Utero ElectroporationHypothalamic DevelopmentMouse EmbryoDNA InjectionThird VentricleElectrode PositioningFluorescence MicroscopyMammillary BodyCell MigrationGenetic Specification

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