Method Article

꿀벌의 RNAi를 매개로 두 유전자 넉다운과 미각 지각 측정 ( 아피스 mellifera)

DOI:

10.3791/50446

⸱

July 25th, 2013

 ,  , 
1School of Life Sciences, Arizona State University , 2Department of Chemistry, Biotechnology, and Food Science, Norwegian University of Life Sciences

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

이 프로토콜에서는, 우리는 동시에 꿀벌 두 개의 유전자 (더블 유전자 최저를) 억제 두 가지 전략에 대해 설명합니다. 그럼 우리는 꿀벌 미각 지각을 두 번 유전자 최저의 효과를 연구하는 코 확장 응답 (PER) 분석을 사용하는 방법을 제시한다.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

이 비디오는 이중 가닥 RNA (dsRNA) 주사를 사용하여 꿀벌에서 동시에 두 개의 유전자를 downregulate RNA 간섭 (RNAi의)의 소설 기법을 보여줍니다. 또한 미각 지각을 측정하기위한 코 확장 응답 (PER) 분석의 프로토콜을 제공합니다.

RNAi를 매개 유전자 때려 눕힘은 표적 유전자의 발현을 downregulating 효과적인 기술이다. 이 기술은 일반적으로 하나의 유전자 조작을 위해 사용하지만, 그것은 상호 작용과 유전자 사이의 공동 효과를 감지하는 한계를 가지고있다. 이 비디오의 첫 번째 부분에서, 우리는 동시에 두 개의 유전자 (더블 유전자 최저라고도 함) 노크하는 두 가지 전략을 제시한다. 우리는 두 전략을 효과적으로 규제 피드백 루프에있는 두 개의 유전자, 비텔로 제닌 (VG)과 ultraspiracle (USP)를 억제 할 수 있습니다 보여줍니다. 이 두 유전자 녹다운 방식은 유전자 사이의 상호 관계를 해부하는 데 사용할 수 있으며 쉽게 적용 할 수있다다른 종의 곤충.

이 비디오의 두 번째 부분은 두 유전자 최저의 치료 후 꿀벌의 코 확장 응답 (PER) 분석의 데모입니다. PER 분석은 꿀벌, 꿀 꿀벌의 행동 성숙이 얼마나 빨리에 대한 중요한 예측 인자로 미각 지각을 측정하는 표준 테스트입니다. 둥지 꿀벌의 큰 미각 인식은 종종 화분에 전문성을 구하고과 꼴의 발병 이전의 시대와 연관되어 증가 된 행동 발달을 나타냅니다. 또한, PER 분석은 꿀벌에 포만이나 굶주림의 대사 상태를 식별하기 위해 적용 할 수 있습니다. 마지막으로, 분석 원에 꿀벌이 널리 꿀벌의 학습과 기억 연구에 사용되는 에어컨에 대해 서로 다른 냄새 자극을 페어링과 함께.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

RNA 간섭 (RNA interference, RNAi) 진핵 생물의 다양한에서 발생하는 RNA 기반의 전사 후 유전자 침묵입니다. RNAi의 과정은 내인성 또는 외인성 이중 가닥 RNA (dsRNA) 전구체에 의해 트리거됩니다. dsRNA에 귀속 작은 조각 (20 ~ 25 BP)에 dsRNA의를 클리브 리보 뉴 클레아 단백질 주사위 놀이를 활성화합니다. 다음 dsRNA에 가이드의 작은 조각 argonaute 단백질에 의해 보완의 mRNA의 인식과 분열, RNA 유도 침묵 복합 (RISC) 1의 촉매 성분. 포유류, 30 NT 이상 dsRNAs는 RNA 전사 2 비특이적 저하로 연결 바이러스 반응 (인터페론 반응 IFN)을 활성화합니다. 그러나 긴 dsRNAs이 IFN 3의 부족이 있기 때문에 벌레에 효과적이고 구체적으로 입증했다.

긴 dsRNAs는 다른 곤충 종 표적 유전자의 downregulation은 사용되어왔다. 꿀 꿀벌 파이온 중 하나입니다EER 곤충 유기체는 어떤 개발 및 행동에 많은 중요한 유전자의 기능은 dsRNA가 4,5를 사용하여 공개하고 있습니다. 여러 dsRNA를 전달 방법은 꿀벌에서 수행되었습니다 dsRNA를 주입 꿀 꿀벌 배아 4 성인 꿀벌 7,8에서 유전자 최저에 대한 효과적인 접근 반면 dsRNA를 먹이는 효율적으로, 꿀벌 유충 6 표적 유전자 발현을 downregulates.

곤충에 dsRNA에 적용하여 전시 유전자 넉다운 효과를 과도 지역화 된입니다. 연구는 복부 dsRNA를 주입하고 가슴 dsRNA를 주입 모두 효과적으로 곤충 9,10의 복부 체지방 세포에서 표적 유전자의 발현을 억제하는 것으로 나타났습니다. dsRNA를이 세포가 10 목욕하는 혈 림프에서의 dsRNA를 취할 수 있습니다 복부 및 흉부 충치와 체지방 세포로 주입된다. 그러나, 난소와 뇌 등 다른 장기에서 유전자가 하나의 대상이 될 수 없습니다복부 또는 흉부 주사. 꿀벌 뇌의 유전자를 표적으로하기 위해, dsRNA를의 뇌 주입 효과적으로 지역의 뇌 영역 11 표적 유전자의 발현에 영향을주는, 수행되었습니다. 여기, 우리는 어른 꿀벌에 더 일반적으로 사용되는 복부의 dsRNA 주입을 문서화합니다.

RNAi를 주로 단일 유전자를 대상으로하는 데 사용되었습니다 및 유전자 기능을 밝혀하는 강력한 도구이다. 그러나, 어떤 유전자는 다른 사람들로부터 고립되지 않고 복잡한 규제 네트워크에 있습니다. 생물학적 과정을 이해하는 열쇠는 유전자가 여러 유전자의 동시 조작이 아닌 단일 유전자 최저를 요구하는 서로 상호 작용하는 방법을 해부하는 것입니다. 포유 동물 세포 라인에서, 과학자들은 전달 시스템 12 또는 다중 마이크로 RNA (miRNA의) 자형 디자인 13를 사용하여 동시에 억제 두 개 또는 세 개의 유전자에 성공했다. 그러나 곤충의 여러 유전자 knockdowns은 아직 검증되지 않은 수 있습니다. 여기, 우리는 프리젠이중 유전자 최저를 달성 할 수 t 다른 분사 전략. 난황 단백질 전구체를 인코딩 및 청소년 호르몬 (JH)에 대한 추정 수용체를 인코딩하고 ultraspiracle (USP)는 꿀벌의 JH 14에 대한 응답을 중재하는 전사 인자로서 역할을 할 수 비텔로 제닌 (VG) : 우리는 2 개의 유전자를 대상으로. VG와 JH는 피드백 루프 15 서로를 조절 꿀 꿀벌의 행동 규칙 9에 참여하고 있습니다. 두 유전자 최저를 사용하여, 우리 교란 VG 모두와 JH 경로, 그리고 그들이 공동으로 꿀벌의 행동과 생리학 및 방법 VG, USP 및 JH 9 상호 작용에 미치는 영향을 발견 할 수 있습니다.

미각 인식 꿀 꿀벌 사회적 행동 16 행동 예측이다. 높은 미각 인식과 행동 발달, 둥지 꿀벌 행동으로 성숙 빠르고, 일반적으로 삶의 초기 사료의 측면에서 꽃가루 16,17를 수집하는 것을 선호합니다. 하지만 규제 m미각 인식을 기본 echanisms는 연구 미각 지각이 내부 에너지 대사 9, 호르몬 분비 18,19 및 생물 발생 아민 20 통로로 연결되어있는 것으로 나타났습니다, 아직 불분명하다. VG와 JH 모두 변조 미각 인식 7,21 중요한 호르몬 레귤레이터이다. 실험실에서, 꿀벌의 미각 인식의 변화가 다른 자당 솔루션 코 확장 응답 (PER) 시험에 의해 평가 될 수있다. 각 꿀벌은 0.1 오름차순 농도 시리즈, 0.3, 1, 3, 10, 30 % 자당 다음에 물 방울과 그녀의 안테나를 모두 터치 테스트합니다. 물이나 자당의 물방울은 각 안테나에 터치하면 꿀벌이 완전히 그녀의 코를 확장하는 경우 긍정적 인 반응이 주목된다. 솔루션 긍정적 인 응답의 수에 따라 각 개인의 미각 인식 수준은 16 결정될 수있다. 그러나 PER의 응용 프로그램은 g의 측정에 국한되지 않습니다ustatory 인식. PER은 또한 포만 대 기아로 꿀벌의 대사 상태를 테스트 할 수있는 효과적인 방법입니다. 자당에 큰 반응과 꿀벌은 일반적으로 배고프 (왕과 Amdam, 게시되지 않은 데이터)입니다. 또한, PER 패러다임 꿀벌의 연관 학습과 기억에서 사용될 수있다. 이 경우 꿀벌은 냄새와 자당 물의 존재를 연결하는 훈련을한다. 꿀벌 관계를 배울 때, 냄새 만 존재 자당 22,23으로 그들을 보상을하지 않고 긍정적 코 응답을 보여주고 있습니다. 이 비디오에서는, 우리는 이전의 연구 9 VG와 USP 더블 최저로 연결되어 미각 인식을 평가하는 PER을 수행하는 방법을 보여줍니다.

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Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1 부 : RNAi를 매개로 두 유전자 최저

1. dsRNA를 합성

  1. VG, USP와 꿀 꿀벌 게놈에없는 제어 유전자 인코딩 녹색 형광 단백질 (GFP)을 대상으로 dsRNAs의 디자인 프라이머 : 프라이머 온라인 무료 소프트웨어 Primer3 (사용하여 설계되었다 http://frodo.wi.mit.edu/를 ) .
  2. VG, USP 및 GFP에 대한 dsRNA를 합성 : 시험 관내 전사에 대한 프로 메가에서 사용 RiboMax T7 RNA 생산 시스템.
  3. dsRNA를 정화 :
    1. 변성 renaturation : 열 85 dsRNA에 ° C 5 분하고 1 시간 동안 실온에서 냉각시킨합니다.
    2. DNase의 I 처리 : 각 dsRNA의 반응에 1 μL DNase의 I를 추가하고 튜브를 가볍게 치면을 섞는다. 37 15 분 품어 ° C.
    3. 각 반응에 LS, 부드럽게 반전하여 그들을 혼합 - 150 μL nuclease가없는 물 750 μL TRIZOL 추가튜브를 erting. 30시 5 분 샘플을 품어 ° C.
    4. 각 샘플에 200 ㎕의 클로로포름을 추가합니다. 20 초 동안 적극적으로 섞는다. 4에서 12,000 XG에서 15 분 동안 원심 분리 ° C.
    5. 각각의 새로운 튜브에 뜨는 위상을 전송하고 각 튜브에 500 ㎕의 이소 프로필 알코올을 추가합니다. 반전 튜브로 그들을 섞는다. -20 ° C.에 20 분 동안 혼합물을 품어 4에서 12,000 XG에서 10 분 정도 원심 분리기 ° C.
    6. 상층 액을 제거하고 침전물을 씻어 1,000 ㎕의 75 % 에탄올을 사용합니다. 4에서 7,500 XG에서 5 분 튜브를 원심 분리 한 후 ° C, 건조한 공기 dsRNA의 펠렛과 펠렛을 녹여 핵산 무료로 물을 사용합니다. 유전자 아래로 규제의 효과를 보장하기 위해, dsRNA의 농도는 -10 약 9 ㎍ / μL해야한다.

2. dsRNA에 복부 사출

두 유전자 최저를 들어, 두 가지 전략이 있습니다 : 1) 단 하나 주입 두 유전자의 믹스 dsRNA를하고 인제코네티컷 혼합물 2) 이틀 주입 : 첫 번째 날에 하나의 유전자를 대상으로 한 최초의 dsRNA를 주입하고, 둘째 날에 동일한 꿀벌에 두 번째의 dsRNA를 주입.

  1. 냉기 새로 1 ~ 2 분 동안 4 ° C 냉장고에 꿀벌 나타났다. 꿀벌이 고정되면, 자신의 복부 및 thoraces 사이에 교차 곤충 핀 고체​​ 왁스의 전체 배양 접시에서 병렬로 3-4 벌을 마운트합니다.
  2. 4 ° C 냉장고에 다시 벌을 진정. 꿀벌이 완전히 고정되어 있는지 확인. 그것은 약 1-2 분 걸립니다. 꿀벌이 느슨해 보일 것입니다. 꿀벌 말리거나 뒤틀린 될 경우, 그것은 그들이 너무 오래 피해야하는 냉각 의미합니다. 휴식이 너무 높은 사망률의 원인이 있지만 운동 부상과 사망의 크기를 증가로 완전 고정이 중요합니다.
  3. 해밀턴 마이크로 주사기 일회용 30 G 바늘 (BD)를 넣습니다. 3 μL의 dsRNA를 타고 주사기에 공기 기포가 없는지 확인합니다. 바늘 DAMA을 방지하기 위해 복부의 측면에 삽입내부 장기를 끼울. dsRNA를 흡수 할 수 있도록 천천히 주사기 플런저를 누르십시오. dsRNA를 매우 점성 때문에, 완전히 주사기에서 추방되는 2 ~ 3 초 정도의 시간이 소요됩니다. 완전히 플런저를 아래로 누른 후, 4-5 초 동안 상처에 바늘을 둡니다. 주사 후 3-5 초 동안 꿀벌을 준수하십시오. 상처 혈 림프 물방울 누출되면 꿀벌을 버린다.
  4. 다른 치료에 해당하는 자신의 thoraces을 표시하기 위해 다른 색상을 사용합니다. 단일 분사 전략이 사용 된 경우이 시점에서, 꿀벌은 1 시간 관찰 후 식민지로 다시 배치 할 수 있습니다. 이틀 분사 전략이 사용 된 경우, 최초의 dsRNA에 주입 된 후, 꿀벌 측에 제공 꿀 실린더 메쉬 케이지에 배치되어야하고, 34에서 인큐베이터에 보관 ° C와 80 %의 습도 .
  5. 둘째 날, 메쉬 새장에 꿀벌을 진정하고 왁스 접시에 그들을 마운트하는 단계 2.2 및 2.3을 따릅니다. 이 descri 그대로 두 번째 dsRNA가와 주사를 수행2.4 단계에있는 침대입니다.
  6. 꿀벌은 실온에서 1 시간 동안 복구하고 식민지로 그 (것)들을 소개하겠습니다.

참고 : 넉다운 효과를 정량적 RT-PCR (QRT-PCR)과 웨스턴 블로 팅에 의해 감지 할 수 있습니다. 일반적으로, 최저 효능은 다양하고 많은 요인에 따라 달라집니다. 본 연구에서는 두 유전자 녹다운은 7 일 단일 주사하고 이틀 주사 한 후 검색 할 수 있습니다.

2 부 : 코 확장 응답 (PER) 분석

1. 하이브에서 꿀벌 수집

주사 후 6 일째, 흡연자를 사용하지 않고 식민지에서 처리 꿀벌를 수집합니다. 금속 메쉬 실린더 케이지 꿀벌를 수집합니다. 각 케이지에 3 꿀벌을 유지합니다.

2. PER에 대한 설치 꿀벌

그들은 완전히 고정되어 ° C까지 4시에 꿀벌을 진정. 특별히 PER을 위해 설계 플라스틱 튜브를 수직으로 각 벌을 마운트합니다. 저기서하여 관 내부의 복부를 유지G 두 개의 작은 테이프의 조각, 그리고 관의 바깥으로 튀어 나와 머리를 유지합니다. 작은 플라스틱 열 개의 행이있는 랙에 튜브를 넣어 ID 번호와 함께 각 튜브 (꿀벌)을 지정합니다. 다음 인큐베이터 (34 ° C 및 80 % 습도)로 랙에 처리 꿀벌을 넣고 2 시간 동안 인큐베이터에 보관하십시오.

3. 자당 수용액 시리즈를 준비

0 %로, 0.1 %, 0.3 %, 1 %, 3 %, 10 % 및 30 %의 자당 수용액을 준비하고 15 ~ 20 G 바늘 주사기로 솔루션을로드합니다.

4. 분석 PER

0.1 %, 0.3 %, 1 %, 3 %, 10 % 및 30 %의 자당 수용액 다음에 0 %로 용액 (물)의 물방울과 꿀벌의 안테나를 누릅니다. 먼저 물을 모든 꿀벌을 테스트하고 각 솔루션 사이의 간격을 최소한 2 분을 사용 할 수 있습니다. 따라서, 우리는 일반적으로 각 시험에 대해 적어도 20 꿀벌이 있습니다. 꿀벌이 완전히 그녀의 코를 확장하는 경우, 긍정적 인 반응이 계산됩니다.

5.데이터 관리

미각 응답 점수 (GRS) 각 개인에 대한 총 긍정적 인 반응을 요약. 데이터의 적절한 통계 분석을 수행합니다.

제 3 부. 유전자 최저 검증

지방 기관은 7 일 이전 처리 꿀벌의 또 다른 세트에서 해부한다. 표준 TRIZOL 절차는 DNase의 I 처리 24 뒤에 RNA 추출에 사용됩니다. VG와 USP 유전자 발현은 두 단계 QRT-PCR. 액틴에 의해 분석이 다른 조직에 안정된 표정을 가지고 있기 때문에 참조 유전자로 사용됩니다 꿀벌의. VG와 USP 유전자 게시 실시간 PCR 프라이머는이 실험 24에서 사용됩니다. 데이터가 델타 - 델타 CT 방법 25을 사용하여 분석됩니다.

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Results

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단일 주입 및 2 일 분사 전략이 모두 크게 꿀벌의 성적 수준 VG (편도 ANOVA, p <0.001) (그림 2A) 및 USP (편도 ANOVA, p <0.001) (그림 2B)를 감소 dsRNA에 6 일 후가 주입되었다. dsRNA의 혼합물로 단일 분사와 VG 첫 번째와 USP 초 (VG / USP)로 이틀 주사를 사용하여 USP 성적 증명서의 억제 USP 첫 번째와 VG 초 (USP / VG)을 이틀 주사보다 유의하게 낮았다 (사후 분석, p 혼합물 대 USP / VG = 0.013, p VG / USP 대 USP / VG = 0.019). ...

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

우리의 연구는 동시에 성충 두 개의 유전자를 허물고하는 최초의 노력입니다. 우리의 결과는 dsRNA를 주입 (단일 주입 및 2 일 분사)의 두 가지 전략은 두 유전자 억제하고, VG와 USP의 동시 유전자 침묵에 대한 효과적인 육일 꿀벌 8,9에 dsRNA를 주입 한 후 테스트 할 수있는 것을 보여줍니다. 그러나 유전자 넉다운 효과는 세포 또는 기관에 의해 표적 유전자, 단백질 회전율과 dsRNA를 흡수 효율의 성적 수준에 따라 서로 다른 종의 곤충 다릅니다. 또한, RNAi의 효과는 농도 의존적​​이다. 우리는 새로 등장 꿀벌이 잘 μL의 dsRNA를 받아 들일 수 찾았지만, 4 개 이상의 μL의 dsRNA가 주입 된 경우 사망률이 급격히 증가. 따라서, 이틀 분사 전략은 사출 볼륨의 높은 금액을 필요로 실험 한 주사보다 더 적합 할 수 있습니다.

여기, 두 유전자 최저 9 우리가 개발 한 두 개의 ...

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Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

우리는 공개할 것이 없습니다.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

저자는 실험 지원을위한 에린 Fennern에게 감사의 말씀을 전합니다. 이 작품은 노르웨이 연구위원회 (180504, 185306 및 191699), PEW 자선 신탁, 그리고 노화에 국립 연구소 (NIA P01 AG22500)에 의해 재정 지원되었다.

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
GE Healthcare PCR 비드 96웰 플레이트GE Healthcare27-9557-01
QIAquick PCR 정제 키트Qiagen28104
RiboMax T7 RNA 생산 시스템PromegaP1300
Trizol LSInvitrogen10296028
클로로포름:이소아밀 알코올 24:1Sigma-AldrichC0549
이소 프로필 알코올Sigma-AldrichI9516
Hamilton 마이크로 주사기Hamilton80301
30G BD 일회용 바늘BD Biosciences305106
자당Sigma-Aldrich84097
1 ml 주사기BD Biosciences30960
실체 해부 현미경Leica MicrosystemsS6D
곤충 핀파인 사이언스 도구26000-25
왁스 플레이트

References

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