방법 논문

MBP 기반 태깅 전략에 의해 Mgm101 재조합 단백질의 제조

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DOI:

10.3791/50448

⸱

2013년 6월 25일

 ,  ,  , 
1Department of Biochemistry and Molecular Biology, State University of New York Upstate Medical University

이 논문에서

요약

효모 미토콘드리아 핵 양체 단백질, Mgm101이 큰 올리고머 고리를 형성하는 Rad52 형 재조합 단백질이다. 프로토콜은 말토오스 결합 단백질 (MBP) 태그 양이온 교환 및 크기 배제 크로마토 그래피와 결합 전략을 사용하고 수용성 재조합 Mgm101 준비를 설명합니다.

초록

MGM101 유전자는 미토콘드리아 DNA의 유지에있는 그것의 역할을 위해 20 년 전에 발견되었다. 여러 그룹에서 연구 Mgm101 단백질이 미토콘드리아 DNA의 재조합 복구에 관여하는 것을 제안했습니다. 최근 조사 Mgm101이 Rad52 형 재조합 단백질의 가족과 관련된 지적했다. 이 단백질은 큰 올리고머 고리를 형성하고 일치하는 단일 가닥 DNA 분자의 풀림을 촉진합니다. 그러나 Mgm101의 특성은 재조합 단백질을 생산의 어려움에 의해 방해되었다. 여기 재조합 Mgm101의 준비를위한 믿을 수있는 절차를 설명합니다. 말토오스 결합 단백질은 (MBP) 태그 Mgm101 먼저 대장균에서 발현된다. 융합 단백질은 처음 아밀로오스 친 화성 크로마토 그래피로 정제한다. 단백질 가수 분해 분열에 의해 발표 된 후, Mgm101는 양이온 교환 크로마토 그래피로 MBP에서 분리됩니다. 단 분산 Mgm101은 다음 얻을 수있다크기 배제 크로마토 그래피 있습니다. 세균성 문화의 리터 당 Mgm101의 ~ 0.87 밀리그램의 수익률은 정기적으로 얻을 수 있습니다. 재조합 Mgm101는 DNA 최소한의 오염을 보유하고 있습니다. 준비된 샘플이 성공적으로 Mgm101의 생화학 적 구조 및 단일 입자 이미지 분석에 사용됩니다. 이 프로토콜은 또한으로 misfolded 및 박테리아 세포에 독성이 될 수있는 다른 큰 올리고머 DNA-결합 단백질의 준비를 위해 사용될 수있다.

서론

상동 재조합 이중 가닥 나누기의 수리 (DSBs) 및 interstrand 가교를 위해 및 축소 복제 포크 1 DNA 복제의 reinitiation 중요합니다. 기존의 상동 재조합에, 중앙 반응은 원핵 생물에서 RECA 및 Rad51와 1-3 진핵 생물 Dmc1 등 ATP-의존 recombinases에 의해 촉매된다. 이 recombinases 양면 DNA 템플릿 (그림 1 왼쪽 패널) 4-7에서 동성 검색 및 가닥의 침공을 시작하기에 필수적인 ssDNA에 핵 단백질 필라멘트를 형성한다. 기존의 방식에 더하여, 상동 재조합은 RecA/Rad51-independent 방식 (그림 1, 오른쪽 패널)에 자리를 취할 수 있습니다. 예를 들어, 효모 Rad52 및 Rad59 단백질은 직접 dsDNA 나누기 resectioning에 의해 노출되는 보완 ssDNA 가닥의 어닐링을 촉진 할 수 있습니다. 노래로 알려진이 재조합 과정르 가닥 어닐링, 일반적으로 동종 dsDNA 템플릿을 페어링 포함되지 않습니다. 어닐링 후, 이종 꼬리 exonucleases에 의해 제거하고 흠이 게놈 연속성 8-10을 복원 할 결찰하고 있습니다. 한 가닥 어닐링 기계의 수리는 종종 직접적으로 반복 영역 사이의 게놈 시퀀스의 삭제가 붙어 있습니다.

Rad52는 살균 11 사이에 널리 퍼져 재조합 단백질의 다양한 그룹에 속한다. 이 단백질은 또한 동종 단일 가닥 DNA 분자의 풀림을 촉진 자신의 활동을 기반으로, 단일 가닥 어닐링 단백질 (SSAPs)로 알려져 있습니다. 가장 특징 박테리오파지 SSAPs는 Redβ 및 lactococcal 파지 ul36에서 prophage RAC와 Sak의 단백질에서 박테리오파지 λ와 P22, 사각형에서 ERF 수 있습니다. 유사성이 거의 undetect 있지만 SSAPs는 구조적으로, 전형적인 β-β-β-α 배로 특징자신의 기본 시퀀스 수. 10 그들은 모두 형태의 대형 호모 중합체 링 - 체외 12-14 14 배 대칭. 이러한 특성 고차 구조 조직의 기능 의미가 잘 이해되지 않습니다.

우리는 미토콘드리아 게놈의 상동 재조합의 메커니즘을 이해에 관심이 있습니다. 우리는 이전에 사카 cerevisiae의 15 미토콘드리아 DNA의 유지에 필수적입니다 MGM101 유전자를 발견했습니다. MGM101은 이후 미토콘드리아 nucleoids과 연관된 것으로 발견되었으며, DNA를 손상 요원 미토콘드리아의 허용 오차 16이 필요합니다. 그러나 Mgm101의 연구는 재조합 Mgm101을 생산하기 위해 어려움 지난 10 년 다시 개최되었습니다. 우리는 최근에 E.에서 대량으로 용해 Mgm101 생산에 성공했다 MBP 융합 전략을 사용 대장균. 이것은 우리가 그 Mgm101 주식을 보여줄 수있게되었습니다단백질 17,18의 Rad52 - 가족과 함께 생화학 및 구조 유사성. 이 보고서에서는 세 단계 정화 절차는 균일 Mgm101for 생화학 및 구조 분석 (그림 2)을 생산하는 기술입니다.

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프로토콜

이전 연구는 Mgm101의 첫 번째 아미노 말단 22 잔기가 미토콘드리아 19로 가져온 후 쪼개 것으로 나타났습니다. 대장균에서 발현를 들어, 첫 번째 22 코돈이 부족한 MGM101 오픈 읽기 프레임은 PCR에 의해 증폭되어 발현 벡터 PMAL - C2E의 수정 된 버전에 말토오스 결합 단백질 (MBP)를 코딩하는 남성 서열의 하류에 배치됩니다. 이 PreScission 프로테아제 (그림 3)를위한 절단 사이트를 포함하는 링커와 MBP-Mgm101 융합을 생성합니다. 플라스미드는 먼저 E.를 선택하여 구성되어 IPTG와 Xgal 화이트 / 블루 선택하지 대장균의 형질 전환. 결과 플라스미드 PMAL - C2E-MGM101 그런 E.에 소개 대장균은 암피실린 및 클로람페니콜 내성 식민지를 선택하여 BL21-CodonPlus (DE3) RIL을 변형.

1. 표현, 유도, 세포 용해와 DNase의 I 트리트먼트

  1. INOC포도당 (0.2 %), 암피실린 (100 ㎍ / ㎖) 및 클로람페니콜 (50 ㎍ / ㎖)를 첨가 LB 배지 10 ㎖ (1 % Bacto 트립 톤, 0.5 % 효모 추출물, 1 %의 NaCl)에 새로운 형질을 ulate. 200 rpm으로 진탕 37 ° CO / N에 품어.
  2. 위와 같이 보충 LB 배지 2 리터에 10 ㎖의 예비 컬쳐 접종. OD 600이 0.5에 도달 할 때까지 흔들어 37 ° C에서 세포를 성장.
  3. 0.3 mm의 최종 농도에 이소 프로필 β-D-1-티오 갈 락토 피 라노 시드 (IPTG)를 추가하여 MBP-Mgm101 융합 단백질의 발현을 유도. 5 시간 동안 30 ° C에서 진탕 세포를 성장.
  4. 베크 JA-10 회 (5,500 XG, 4 ° C, 10 분)를 사용하여 원심 분리하여 세포를 수집합니다. 폐기 후 상층 액은 단백질 분해 효소 억제제 (25 μM의 펩틴, 1 μM의 pepstatin 및 1 ㎜ PMSF)를 포함 용해 버퍼의 30 ML (20 MM 트리스 - 염산, 산도 7.4, 1 mM의 EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산), 산도 7.4)에있는 세포 펠렛을 resuspend.
  5. 20 얼음에 세포 현탁액을 초음파 처리초 초음파 프로세서 (열 시스템, 모델 W-385)를 사용하여 50 % 듀티 사이클에서 30 초 동안 얼음에 냉각하고, 배 반복 할 수 있습니다.
  6. 2 MG / ML에서 DNase의 1 주식의 1 ML을 추가합니다. 2 시간 동안 4 ° C에서 세포 해물 바위.
  7. 500 mm의 최종 농도에 NaCl을 조정합니다.
  8. 30 분 동안 4 ° C에서 10,000 XG에서 원심 분리하여 세포 파편을 제거합니다.

2. 아밀로오스 친 화성 크로마토 그래피로 정제

  1. 용해 버퍼의 아밀로스 수지 (50 % 슬러리)의 1.5 ml의 평형. 세포의 파쇄에 평형 아밀로스 수지를 추가합니다. 4 ° CO / N.에 가볍게 흔들어
  2. 찬 방에 설치 이코노 컬럼 크로마토 그래피 칼럼에 해물 수지의 혼합을로드합니다. 언 바운드 단백질이 중력에 의해 열을 전달할 수 있습니다.
  3. 세척 버퍼 I (; 400 mM의 NaCl을, 1 ㎜ EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산), 산도 7.4, 0.2 mM의 PMSF 20 MM 트리스 - 염산, 산도 7.4) 300 ml의 아밀로오스 수지 씻으십시오.
  4. 세척 버퍼 II (20 mM의 T 150 ml의 세척을 반복RIS-염산, 산도 7.4, 200 MM의 염화나트륨, 1 ㎜ EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산), 산도 7.4, 0.2 mM의 PMSF).
  5. 열, 4 품어 10 분 ° C, 수집 용출 버퍼의 5 ML을 (; 200 mM의 NaCl을; 1 ㎜ EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산), 산도 7.4 및 0.2 mM의 PMSF, 10 MM 토스 20 MM 트리스 - 염산, 산도 7.4)을 추가 더 많은 시간을위한 용출액를 반복하십시오.
  6. 용출액을 결합, 쿠마시 염색 (그림 4) 다음 SDS-PAGE 젤에 용출액의 나누어지는을로드하여 MBP-Mgm101의 수율과 순도를 결정합니다.

3. PreScission 프로테아제 분열과 양이온 교환 크로마토 그래피

  1. MBP-Mgm101 용출액에 PreScission 프로테아제의 50 단위를 추가합니다. 4의 절단 ° CO / N를 수행하고 (20 MM 트리스 - 염산, 산도 7.4, 100 MM의 염화나트륨, 2 mM의 DTT, 1 mM의 EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산), 산도 7.4, 0.2 mM의 PMSF)는 투석 버퍼에 대한 투석 동안 계속할 수
  2. SDS-PAGE 젤 (그림 5A)의 분열의 효율성을 확인합니다.
  3. 여러가 주입에 의해 절단 된 MBP-Mgm101를로드바이오 스케일 미니 매크로 준비 높은 S 카트리지 이온은 바이오 방사선의 생물학적 DuoFlow FPLC 시스템에 연결되어 있습니다.
  4. 단계 소금 5 mm의 그라데이션, 300 밀리미터, 500 밀리미터, 750 mm와 혼합 버퍼 A (10 mM의 NaCl을하여 만든 염화나트륨 1,000 밀리미터를 적용하여 양이온 교환 크로마토 그래피를 시작, 10 MM 나 - 인산, 산도 7.2, 1 MM의 PMSF) 및 버퍼 B (1 M의 NaCl, 10 MM 나 - 인산, 산도 7.2, 1 ㎜ PMSF). 0.5 ML / 분에서 유량을 설정합니다. Mgm101 분수를 수집하고 SDS-PAGE 젤 (그림 5B)에서 단백질의 순도를 확인합니다.

4. 크기 배제 크로마토 그래피

  1. 양이온 교환 크로마토 그래피에서 단백질 분수를 결합합니다. (; 150 mM의 NaCl을, 1 ㎜ EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산), 산도 7.4, 5 MM 2 - 메르 캅토 에탄올, 0.2 mM의 PMSF 20 MM의 MOPS, 산도 7.0) GF 평형 버퍼에있는 단백질을 Dialyze.
  2. 4 ° C.에서 3,000 XG에서 회전시켜 ~ 1 ML에 볼륨을 줄이기 위해 VIVASPIN 15R의 여과 스핀 열이 단백질을 집중
  3. Mgm101 (을)를로드NA는 크로마토 그래피 버퍼 (; 150 mM의 NaCl을, 5 MM의 β-메르 캅 토 에탄올, 1 ㎜ EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산), 산도 7.4, 0.2 mM의 PMSF 20 MM의 MOPS, 산도 7.0)로 평형화 Superose 6 준비 급료 열을 보정.
  4. 0.5 ML / 분의 유속으로 실행 크로마토 그래피 버퍼 크기 배제를 시작합니다.
  5. 정제 Mgm101 피크의 분수를 수집합니다. 단백질의 최종 품질 검사를위한 12 % SDS-PAGE에 분수 분주을로드합니다.
  6. VIVASPIN 6 단백질을 농축 한 후 빠르게 -80에서 액체 질소와 저장소에 샘플을 동결 ° C.
  7. ssDNA 결합 분석 (그림 8)의 경우와 투과 전자 현미경 (그림 9)에 의해 구조 시각화를위한 6-12 개월 이내에 Mgm101 샘플을 사용합니다.

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결과

Mgm101은 미토콘드리아에서 Rad52 관련 재조합 단백질이다. Rad52은 광범위 미토콘드리아 DNA 재조합 (그림 1)에서의 역할에 대해 연구하고있다. 재조합 Mgm101은 세 단계의 절차 (그림 2)에 의해 제조 될 수있다. 이 Mgm101는 수용성 형태로 표현하고 이후 (그림 3) 단백질 가수 분해 분열에 의해 태그에서 해제 할 수 있습니다 MBP를 붙이는 전략의 사용에 의해 촉진된다.

일반적인 준비, MBP-Mgm101 융합의 약 2-3 mg의 아밀로오스 친 화성 크로마토 그래피 후 세균 배양 1 리터에서 복구 할 수 있습니다. SDS-PAGE 젤에 MBP-Mgm101는 2 ~ 70 kDa의 (그림 4)의 주요 밴드로 감지됩니다. 수지가 적절하게 용출되기 전에 세척하면 다른 단백질에 의한 오염은 최소화됩니다. PreScission의 단백질 분해 ...

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토론

그것은 E.에서 안정적인 기본 재조합 Mgm101 단백질을 생산하기 위해 도전하고있다 박테리아 세포에서의 용해성을 가능성으로 인해 대장균. 이 보고서에서, 우리는 MBP 융합 전략은 단백질이 비교적 높은 수준에서 표현 될 수 있다는 점을 보여줍니다. 부정적인 염색 투과 전자 현미경 및 크기 배제 크로마토 그래피를 사용하여, 우리는 이전에 MBP-융합 단백질은 생체 18 균일 한 중합체를 형성하는 것으로 나타났습니다. 그것은 Mgm101의 폴딩 및 올리고머는 미토콘드리아의 매트릭스에 비해 박테리아 세포에 속도가 느려질 수 있습니다. unoligomerized Mgm101 신속하게 생체 내 독성 집계를 형성 할 수있다. MBP-태그를 생산 올리고머를 허용하고 독성을 감소 수용성 형태에 Mgm101을 유지 할 수 있습니다.

좋은 품질 Mgm101 준비를위한 중요한 기준은 DNA에 의해 최소한의 오염...

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공개 사항

저자는 그들이 더 경쟁 재정적 이익이 없다는 것을 선언합니다.

감사의 글

우리는 투과 전자 현미경의 도움 스테판 켄스 감사합니다. 이 작품은 건강 그랜트 R01AG023731의 국립 연구소에 의해 지원되었다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
발현 벡터 pMAL-c2ENew England Biolabs#N8066S
PreScission ProteaseGE Healthcare Life Sciences#27-0843-01
BL21-CodonPlus(DE3)-RIL 세포Strategene#230245
LeupeptinRoche Applied Science#11034626001
PepstatinRoche Applied Science#11359053001
Phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF)Roche Applied Science#10837091001
DNAse ISigma#DN25-1G
Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG)Roche Applied Science#11411446001
Amylose resinNew England Biolabs#E8021L
Econo-Column 크로마토그래피 컬럼BIO-RAD#7372512
Bio-Scale Mini Macro-Prep High S 카트리지 (1 ml)BIO-RAD#732-4130
VIVASPIN 15R 한외여과 스핀 컬럼 (10,000 MWCO)Sartorius Stedium#VS15RH02
Superose 6 Prep Grade columnAmersham Bioscirnces#17-0489-01
VIVASPIN 6 Ultrafiltration spin column (5,000 MWCO)Sartorius 스테듐
#VS0611

참고문헌

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  17. Mbantenkhu, M., et al. Mgm101 is a Rad52-related protein required for mitochondrial DNA recombination. J. Biol. Chem. 286, 42360-42370 (2011).
  18. Nardozzi, J. D., Wang, X., Mbantenkhu, M., Wilkens, S., Chen, X. J. A properly configured ring structure is critical for the function of the mitochondrial DNA recombination protein. Mgm101. J. Biol. Chem. 287, 37259-37268 (2012).
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Mgm101MBPDNADNADNA

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