신진 효모의 형광 시간 경과 영화를 획득 및 이식을 사용하여 단일 세포 역학 분석

요약

우리는 형광 성장 효모 세포의 현미경 영화, 단일 셀 시계열 데이터를 추출하는 GUI 기반의 소프트웨어 패키지를 얻을 수있는 간단한 프로토콜을 제시한다. 분석은 자동화 혈통과 육안 검사 및 추적 데이터를 수동으로 큐 레이션과 통합 부문 시간 할당을 포함합니다.

초록

형광 시간 경과 현미경은 단일 세포 수준에서 많은 생물학적 과정의 연구에 강력한 도구가되고있다. 특히, 유전자 발현의 시간적 의존성을 묘사하는 영화는 규제의 역학에 대한 통찰력을 제공하지만, 단일 세포의 형광 영화를 획득하고 분석하는 많은 기술적 과제가있다. 우리는 여기에서 이러한 데이터를 생성하는 상업적으로 이용 가능한 미세 배양 장치를 사용하여 간단한 프로토콜 및 MATLAB 기반의 그래픽 사용자 인터페이스 (GUI) 기반의 소프트웨어 패키지 형광 이미지를 정량화하는 방법에 대해 설명합니다. 소프트웨어 세그먼트와 트랙 세포는, 사용자가 시각적으로 데이터의 오류를 부젓가락 할 수 있도록, 자동으로 혈통과 분열 시간을 지정합니다. GUI는 또한 전체 셀 추적뿐만 아니라 첫 번째와 두 번째 유도체를 생산하는 시계열을 분석합니다. 소프트웨어는 S.를 위해 설계되었습니다 동안 cerevisiae의 그 모듈과 다양성은 그것에게 t을 허용해야몇 가지 수정을 다른 세포 유형을 공부하는 플랫폼 역할을 O를.

서론

유전자 발현의 단일 세포 분석은 유전자 조절의 여러 측면에 대한 우리의 이해를 발전한있다. 유동 세포 계측법 또는 현미경을 사용하여 형광 기자 표현식의 정적 스냅 샷은 단일 셀 표현의 분포에 대한 유용한 정보를 제공하지만, 역사와 직접적으로 유전자 발현 역학을 통보하는 데 필요한 시간 시리즈 데이터의 진화를 부족합니다. 형광 시간 경과 현미경 단일 세포 측정 및 그들의 역사를 모두 얻을 수있는 수단을 제공합니다. 다양한 실험 및 분석 기술은 따라서 이러한 휴대 전화의 변화 ^2,3, 세균 persister 형성 ^4, 전사 등의 유전자 조절 기능에 대한 통찰력을 (검토를 위해 ¹ 참조) 부여, 형광 기자 식의 영화를 획득하고 정량화하기 위해 개발되었습니다 시작과 신장 ^{5, 6,7 파열} 전사, 세포주기 의존 ^8,9, 및 유전 ^10. 그러나 OBTaining 품질의 단일 세포 형광 시계열 배양에서 상당한 기술적 도전 제어 환경에서 획득 한 형광 영화의 높은 처리량 정량에있는 세포의 단일 층을 포함한다. 여기에, 우리는 S의 형광 영화를 획득하고 분석하는 절차를 설명 세포 배양 장치 제조 또는 소프트웨어 개발없이 필요한 경험 (그림 1)....

프로토콜

1. 미세 유체 챔버에서 성장하는 단일 효모 세포의 형광 현미경 동영상을 얻을

1. 갓 성장 플레이트의 세포와 1 ML SC 미디어 (2 % 포도당과 아미노산의 완전한 보완이 합성 정의 미디어) 접종하고, 30 ℃에서 롤러 드럼 ~ 16 시간 배양 밤새 배양 최종 OD _{600nm의 조기} 로그 단계 성장 ~ 0.1이다 문화 등 준비합니다.
2. OD _600nm의 = 0.1 스타터 필요에 따라 문화와 신선한 테스트 튜브에서 자라지 1 ML을 추가 6-8시간을 희석. 이 microfluidic 장치에로드하는데 적절한 농도로 영양이 풍부한 정상 상태로 성장 세포를 제공합니다. (또는, 실험에 필요한 세포를 준비하는 데 필요한 절차 단계 1.1-1.2를 대체합니다.)
3. CellAsic에서 Y04C 미세 배양 플레이트를 준비 배송 용액을 제거, 멸균 물 우물을 씻어하고, ONIX 관류 시스템 흐름을 사용하여채널을 플러시 5 분 10 PSI에서 우물 1-6를 통해 물. 그런 다음 10 초 (로드 채널이 훨씬 더 높은 유속이 별도로 플러시해야한다) 6 PSI에 잘로드 8의 흐름.
4. 모든 우물에서 물을 제거하고 잘 8로드 셀의 입구에 250 μL SC 우물 1-6 단계와 1.2 문화의 50 μL로 교체합니다.....

결과

성공적으로 수행하고 분석 실험은 현실적으로 할당 봉오리 출현과 분열 시간을 갖는 단일 전체 셀에 대한 대부분의 연속적인 시계열을 얻을 것입니다. 예를 들어, 우리는 성장과 글로벌 식 단세포 시간 (표 4, Y47에 다를 수 있습니다 방법을 관찰하기 위해 제정 ADH1 프로모터에 의해 구동 리안 형광 단백질의 통합 사본 (CFP)를 표현하는 반수체 효모 균주 위의 프로토콜을 수행 ). 우리는 시간이 지남에 따라 (그림 7A) 측정 전체 셀을 얻기 위해 시계열 분석을 실행하고, ⁹ 발견 세포주기에 의존 볼륨과 표현 모두 나온다. 단백질 농도, 또는 평균 강도가 약간 (그림의 7B 및 7C) 감소하면서 봉오리 형성 한 후, 총 결합 된 볼륨 (어머니 + 새싹) ^(8,16와 일치) 더 빨리 봉오리 출현 이전보다 증가합니다. 결합 INTEGRA 상승테드 단백질 (이 경우 볼륨.......

토론

위의 프로토콜은 마이크로 유체 또는 소프트웨어 개발에 대한 경험과 형광 시계열 데이터를 확보하고 분석하는 간단한 방법을 설명합니다. 그것은 하나의 단일 효모 세포의 시간 경과 형광 영화를 얻을 수 있습니다, 부목사 추적 및 계보 할당; 해당 셀 크기와 표현 측정을 추출하고 상업적으로 이용 가능한 미세 배양 장치를 사용하여 시간과 다양한 그래픽 사용자를 통해 전체 세포의 동작을 분석 인터페이스 (GUI). 실험, 분할 및 추적 단계는 다양한 방법으로 이전 ^{11,13,14으로} 접근하고 있지만, 위의 절차는 생물학 사회의 광범위한 집합에 이러한 기술에 더 쉽게 액세스 할 수 있도록 설계되었습니다. 위의 절차가 특정 미세 배양 장치에 최적화되어 있지만, 전반적인 분석은 저렴하고 더 정의가 기성 미세 배양 기술로 유사한 장치에 적용 할 수 있습니다. fundam을entally, 우리는 고용 분할 및 지역 측정 알고리즘은 기존의 방법 ^13,14 비슷하지만 이식 소프트웨어는 시각적 영역 추적 및 계보.......

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
Y04C 효모 관류 플레이트	CellAsic	Y04C-02
ONIX 미세유체 관류 플랫폼	CellAsic	EV-262
Axio Observer.Z1 현미경	Zeiss
Plan-Apochromat 63x/1.40 Oil DIC objective	Zeiss	440762-9904-000
Cascade II EMCCD 카메라	광량
루멘 200 메탈 할라이드 아크 램프	PRIOR Scientific
삼중 대역 통과 이색성 필터 큐브 및 여기 및 방출 필터 세트	Chroma Technology Corp	세트 #89006	YFP(Venus/Citrine), CFP(Cerulean), RFP(mCherry/tdTomato)
MAC 5000 컨트롤러 및 필터 휠	Ludl Electronic Products
MATLAB R2011a	Mathworks		64비트 버전은 32비트보다 대용량 데이터 파일을 더 잘 처리합니다.

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