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방법 논문

단백질 지혜 : 용 워크 벤치

16.4K 조회수

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DOI:

10.3791/50476

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2013년 7월 25일

 ,  ,  ,  , 
1Department of Chemical and Biological Engineering, Princeton University

이 논문에서

요약

우리는 단백질 설계의 몇 가지 중요한 영역을 다룰 수 있는 computational de novo 단백질 설계 방법을 개발했습니다. 이러한 방법을 보급하기 위해 단백질 설계를 위한 온라인 도구인 Protein WISDOM을 제시합니다(http://www.proteinwisdom.org). 구조적 주형에서 시작하여 안정성 향상을 위한 단량체 단백질과 결합 친화도 향상을 위한 복합체의 설계를 수행할 수 있습니다.

초록

드 노보 단백질 설계의 목적은 기본 순서를 기준으로 같은 결합력, 작용제 또는 길항제의 행동이나 안정성 등의 특정 속성, 개선에 필요한 3 차원 구조로 접을 것 아미노산 서열을 찾을 수 있습니다. 단백질 디자인은 현재 발전 약물 설계 및 발견의 중심에 자리 잡고 있습니다. 뿐만 아니라 단백질 디자인은 잠재적으로 유용한 약물 표적에 대한 예측을 제공하지만, 그것은 또한 단백질 폴딩 과정과 단백질 - 단백질 상호 작용에 대한 우리의 이해를 향상 않습니다. 같은 방향 진화 등의 실험 방법은 단백질 디자인에서 성공을 보여 주었다. 그러나, 이러한 방법은 tractably 검색 할 수 있습니다 제한된 순서 공백으로 제한됩니다. 반면, 전산 설계 전략 특성과 다양한 기능을 포함 시퀀스의 훨씬 더 큰 집합의 심사 할 수 있습니다. 우리는 전산 드 노보 단백질 디자인 METHO의 범위를 개발했습니다단백질 설계의 몇 가지 중요한 영역을 다루는 능력 DS. 이러한 증가 바인딩 선호도 증가 안정성과 단지에 대한 단량체 단백질의 디자인이 (가) 있습니다.

넓은 위해 이러한 방법을 전파하는 것은 우리가 단백질 지혜 (현재 사용 http://www.proteinwisdom.org ), 단백질 설계 문제의 다양한 자동화 된 방법을 제공하는 도구입니다. 구조 템플릿은 디자인 프로세스를 초기화하기 위해 제출됩니다. 설계의 첫 번째 단계는 시퀀스 공간에 잠재적 인 에너지의 최소화를 통해 안정성을 향상을 목표로 최적화 순서 선택 단계입니다. 선택한 시퀀스는 다음 배 특이 무대와 결합 친화 단계를 통해 실행됩니다. 프로세스의 각 단계에 대한 염기 서열의 순위 정렬 된 목록은 함께 관련 설계 구조로, 디자인의 포괄적 인 양적 평가와 함께 사용자를 제공합니다. 여기에서 우리는 세부 사항 O를 제공합니다F 각 설계 방법뿐만 아니라, 방법의 사용을 통해 달성 몇 가지 주목할만한 실험 성공.

서론

De novo protein design은 향상된 특성 또는 기능을 가진 원하는 3차 구조를 생성하는 단백질 서열을 식별하는 것입니다. 단백질의 네이티브 폴드(native fold)는 자유 에너지 최소값에 놓인 형태이기 때문에 de novo protein design은 타겟 폴드에서 자유 에너지 최소값을 갖는 염기서열을 찾습니다. 이 문제는 Drexler1과 Pabo2에 의해 처음 설명되었으며 "역 폴딩 문제"라고 불렸습니다. 그러나 염기서열이 하나의 접힌 구조 솔루션만 생성할 수 있는 단백질 접힘 문제와 달리 de novo protein design 문제는 퇴화를 나타냅니다. 많은 다른 아미노산 서열은 동일한 3차 구조와 기능을 생성할 수 있습니다.

단백질 설계는 전통적으로 합리적 설계와 지시된 진화를 통해 실험적으로 수행되어 왔지만, 최근에는 실험 방법에 내재된 제한된 검색 공간을 극복하기 위해 계산 방법이 채택되었습니다. 결정론적 방법(deterministic method), 확률론적 방법(stochastic methods), 확률론적 방법(probabilistic method)을 포함한 다양한 계산 방법이 사용되어 왔다. 3,4 초기의 계산 방법은 문제를 더 쉽게 해결할 수 있도록 고정 백본 템플릿을 사용했습니다. 5-7 더 빠른 프로세서, 고성능 컴퓨팅 및 더 효율적인 알고리즘의 출현으로 백본 유연성은 고정 백본 템플릿8-14의 앙상블을 사용하거나 원자 간 거리 및 이면각의 범위로 템플릿을 표현하여 진정한 백본 유연성을 통합함으로써 통합되었습니다. 15,16

년

이 백서에서는 새로운 단백질 설계 프레임워크 computational을 활용하기 위해 학계에서 사용할 수 있는 온라인 도구인 Protein WISDOM에 대해 자세히 설명합니다. 이 프레임워크는 HIV, 암, 보체 질환 및 기타 자가면역 질환과 같은 질병을 표적으로 하는 치료용 단백질의 설계에 적용되었습니다. 예측된 펩타이드 중 다수가 실험적으로 검증되어 이 방법의 힘을 입증했습니다. 표 1은 단백질 또는 펩타이드의 크기, 예측 횟수 및 실험적 검증을 포함하여 설계된 다양한 단백질에 대한 요약을 제공합니다.

<테이블 테두리="1"> 단백질 디자인 단백질 길이 # 계산 예측 # 실험적 검증 참조 인간 beta-defensin-2의 가득 차있는 순서 디자인 41의 340의   (17) 인간 C3의 콤프스타틴 억제제 13세 28분 3/3 (18, 19) 쥐 C3c에 결합하는 콤프스타틴 유사체 13세 5 개   (20) 디세린 확장이 있는 콤프스타틴 유사체 15분 8     콤프스타틴 아날로그 W4A9의 안정화 구조 13세 18분     C3a 수용체 작용제 및 길항제 77의 20분 4/7 (21) C5a 수용체 작용제 및 길항제 74의 61의 2/61년   HIV-1 gp14 억제제 12세 6 4/5년 (22) HIV-1 gp120 억제제 9 개 14분     Bcl-x L 및 Bcl-2의 Bak 억제제 16-18호 10분 5/5년 (23) ERK2 억제제 11세 25분     EZH2 억제제 21분 17의 10월 10일 (24) LSD1 및 LSD2 억제제 16세 41의 20월17일   HLA-DR1 억제제 13세 6   (25세) PNP 억제제 5 개 13세    

표 1. De novo Protein Design Framework를 사용하여 설계된 단백질 및 펩타이드 요약. 계산 예측의 #은 유리한 예측의 수로 표시됩니다(즉, 특정 컷오프 이상의 폴드 특이성 또는 기본 시퀀스보다 큰 근사 결합 친화도). # of experimental validations는 두 개의 숫자를 제공합니다: 첫 번째는 실험적으로 검증된 예측의 수이고 두 번째는 실험적으로 테스트된 예측의 총 수입니다.

펩타이드의 항균성을 향상시키기 위해 human-beta-defensin-2 (hβD-2)의 설계가 수행되었습니다. 17 이 설계를 위해 우리는 두 가지 경우를 고려했습니다: 1) hβD-2를 따라 최대 10개의 돌연변이와 2) 시스테인(8, 15, 20, 30, 37 및 38)을 제외한 모든 hβD-2 잔기 위치의 전체 염기서열 설계. 세 가지 다른 디자인 템플릿과 세 가지 다른 시퀀스 선택 모델이 디자인에 사용되었습니다. 돌연변이의 높은 수준의 유사성은 10개의 돌연변이 설계와 전체 염기서열 설계 모두에 대해 가중 평균과 거리 빈 모델 간에 관찰되었습니다. 또한, 많은 수의 염기서열(sequence)이 네이티브 염기서열(native sequence)보다 더 유리하게 계산된 Fold Specificity(폴드 특이성) 값을 갖는 것으로 밝혀졌습니다.

보체 시스템 억제제(C3, C3a 및 C5a)는 뇌졸중, 심장마비, 알츠하이머병, 천식, 류마티스 관절염, 이종 이식 거부 반응, 성인 호흡기 질환, 건선 및 크론병과 같은 여러 면역 질환과 싸우도록 설계되었습니다. 단백질 설계 프레임워크에 의해 예측된 C3c의 콤프스타틴 억제제 3종과 합리적으로 설계된 염기서열 3종은 실험적으로 네이티브 콤프스타틴보다 더 나은 결합제인 것으로 검증되었습니다. 18,19

년

추가 연구에서는 비영장류 C3c에 대한 콤프스타틴의 활성 상실을 조사하고 여러 후보 랫드 및 마우스 C3c 억제제를 설계했습니다. 5개의 염기서열은 C3c를 억제하는 것으로 알려진 W4A9 콤스타틴 돌연변이보다 쥐 C3c와 더 유리한 연관 자유 에너지를 갖는 것으로 나타났습니다. 이것은 Arg1에 의한 새로운 소금 다리 형성 때문입니다. 20 N-말단 확장을 가진 8개의 염기서열은 디세린 확장을 가진 W4A9보다 더 나은 결합체로 예측되었습니다. 마지막으로, 18개의 콤프스타틴 염기서열은 W4A9의 결합 형태를 안정화하여 영장류 및 비영장류 C3c 억제제에 대한 강력한 후보를 제공하는 것으로 예측되었습니다.

C3c 억제제 외에도 C3a 및 C5a 수용체 작용제 및 길항제는 C3a 및 C5a의 구조를 기반으로 설계되었습니다. 모델에 의해 예측된 7개의 C3a 염기서열을 실험적으로 테스트했습니다. 염기서열 중 2개는 강력한 작용제였고 다른 2개는 부분 작용제였다. 21 두 가지 강력한 작용제는 이전에 발견된 "초작용제"에 비해 58배의 개선을 보였다. C5a 수용체 작용제 및 길항제의 설계는 61개의 염기서열 세트를 제공했습니다. 모든 염기서열을 합성하였고 2개는 새로운 C5a 작용제인 것으로 밝혀졌습니다.

AIDS를 일으키는 바이러스인 HIV-1의 융합 억제제는 HIV-1이 세포를 감염시키는 것을 막기 위해 고안되었습니다. 첫 번째 설계는 HIV-1의 외피 당단백질인 gp41을 표적으로 했습니다. 단백질 설계 프레임워크는 네이티브 염기서열보다 더 나은 결합재인 6개의 염기서열을 예측했습니다. 이러한 예측된 염기서열 중 4개는 IC50이 29μM만큼 낮은 최상의 염기서열로 HIV-1을 억제하는 것으로 실험적으로 검증되었습니다. 이 염기서열은 네이티브 염기서열보다 3-15배 개선된 것으로 나타났으며 Enfuvirtide 내성 바이러스 균주에 대해 활성을 잃지 않았습니다. 22 두 번째 설계는 HIV-1의 또 다른 외피 당단백질인 gp120을 표적으로 했습니다. 14개의 염기서열은 gp120의 결합체이며 HIV-1의 추가적인 잠재적 융합 억제제를 제공하는 것으로 예측되었다.

암과 관련된 수많은 단백질이 암 치료의 유망한 표적을 제공했습니다. Bcl-2 및 Bcl-xL은 세포 사멸을 예방하는 항세포사멸 단백질입니다. 이 두 단백질의 억제제는 암세포에서 세포 사멸을 유도하도록 설계되었습니다. 10개의 염기서열은 네이티브보다 더 나은 결합재로 예측되었으며, 이러한 결과는 이전의 실험 및 돌연변이 유발 결과를 포착했습니다. 23 또 다른 표적 단백질인 ERK2는 항증식성 암 치료의 유망한 표적이 되는 신호 전달 캐스케이드에 관여합니다. 25개의 염기서열이 ERK2의 억제제인 것으로 예측되었다.

히스톤 메틸전이효소 및 탈메틸화효소는 전립선암, 유방암, 림프종, 골수종, 방광암, 결장, 피부암, 간암, 자궁내막암, 폐암, 위암 등 많은 암과 관련된 히스톤 메틸화를 동적으로 제어합니다. de novo protein design framework는 EZH2(Lysine methyltransferase)의 17가지 억제제를 확인했으며, 실험적으로 테스트된 10가지 중 모두 EZH2를 억제하는 것으로 밝혀졌습니다. 24 가장 강력한 펩타이드는 약 13μM의 IC50을 가졌고, 효소 농도가 높아도 동일하게 효과적이었으며, 보조인자와 경쟁하지 않았습니다. 이 펩타이드는 EZH2의 첫 번째 억제제 세트였습니다. 프레임워크에 의해 53개의 LSD1 억제제(탈메틸화효소)가 예측되었으며, 실험적으로 시험된 20개의 억제제 중 17개는 LSD1의 억제제였고 18개는 LSD2의 억제제였다. 최고의 억제제는 IC50 값이 1μM 미만으로 현재까지 발견된 가장 강력한 펩티드 억제제입니다.

마지막 두 단백질 시스템은 셀리악병, 진성 당뇨병 1형, 전신성 홍반성 루푸스, 쇼그렌 증후군, 츄르그-스트로스 증후군, 하시모토 갑상선염, 그레이브스병, 특발성 혈소판 감소성 자반병, 류마티스 관절염 및 알레르기와 같은 다양한 자가면역 질환을 치료하기 위한 표적을 제공했습니다. 이러한 잠재적 억제제 중 어느 것도 실험적으로 검증되지 않았지만, 프레임워크는 HLA-DR1에 결합하는 6개의 염기서열과 PNP에 결합하는 13개의 염기서열을 예측했습니다.

표 2는 de novo protein design framework를 사용하여 예측된 실험적으로 검증된 억제제 및 작용제를 요약한 것입니다. approximate binding affinity metric은 9개의 염기서열(human C3c, HIV-1 gp41, EZH2, LSD1 및 LSD2 억제제)을 예측하는 데 사용되었으며, fold specificity metric은 4개의 염기서열(C3aR의 agonists/antagonist)을 식별하는 데 사용되었습니다. 이러한 펩타이드는 de novo 단백질 설계 프레임워크, 특히 추가된 근사 결합 친화도 메트릭의 성공을 강조합니다. 이 프레임워크는 적용 가능성이 매우 다양합니다. 25개의 서로 다른 질병과 관련된 6개의 서로 다른 단백질이 성공적으로 설계되고 실험적으로 검증되었습니다.

<표 테두리 ="1" cellpadding ="1" cellspacing="1" 높이 ="147" 너비 ="856"> 이름 IC50 시리즈 50 EC50 단백질 타겟 적용 가능한 질병 SQ027 0.94 μM의   인간 C3c 뇌졸중, 심장마비, 알츠하이머병, 천식, 류마티스 관절염, 전신성 홍반성 루푸스, 다발성 경화증, 건선, 당뇨병 I형, 크론병, 췌장염 및 낭포성 섬유증 SQ086 1.98 μM   인간 C3c SQ059 4.73 μM   인간 C3c SQ110-4 (단편)   15.2 nM C3아르 SQ060-4 (단편)   36.4 nM C3아르 SQ007-5 (단) 15.4 nM   C3아르 SQ002-5 시리즈 26.1 nM   C3아르 SQ435 29 - 253 마이크로미터   HIV-1 gp41 AIDS SQ037 13.57 μM   이즈2 전립선, 유방암, 림프종, 골수종, 방광암, 결장암, 피부암, 간암, 자궁내막암, 폐암 및 위암 SQ011-1 (단) 0.521 μM   증권 시세 표시기1 SQ016-1 0.249 μM   증권 시세 표시기1 SQ026-1 2.51 μm   증권 시세 표시기2 SQ015-1 1.332 μM   증권 시세 표시기2

표 2. 다양한 질병을 표적으로 하는 전산을 통해 예측하고 실험적으로 검증된 펩타이드.

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프로토콜

방법 개요

Protein WISDOM에서 사용된 de novo 설계 프레임워크는 두 단계로 구성됩니다. 첫 번째 단계에서는 주어진 템플릿 구조로 접힐 아미노산 서열의 순위 목록을 생성합니다. 두 번째 단계에서는 접힘 특이성 또는 근사 결합 친화도, 또는 두 가지 모두를 계산하여 이들 서열을 검증합니다. 전자는 주로 단일 단백질을 설계할 때 사용되며, 후자는 복합체(표적 단백질에 결합하는 펩타이드)를 설계할 때 사용됩니다. 그림 1은 이 프레임워크에 포함된 단계들의 개요를 보여줍니다.

설계 입력값: de novo 단백질 설계 프레임워크를 위해 정의해야 할 몇 가지 입력값이 있습니다. 첫 번째는 설계 템플릿입니다. 이는 단백질 내 모든 원자의 좌표를 포함하는 3차원(3D) 단백질 구조입니다. 구조는 강체(rigid) 또는 유연체(flexible)일 수 있습니다. 강체 템플릿은 고정된 원자 좌표 세트로, X선 결정학 구조에서 얻습니다. 유연체 템플릿은 고정된 원자 좌표 세트이거나 원자 좌표의 상한 및 하한 값일 수 있습니다. 이러한 템플릿은 NMR 용액 구조, 분자 역학 또는 도킹 시뮬레이션을 통해 얻을 수 있습니다.

설계 템플릿은 설계된 단백질의 허용 변이 세트를 생성하는 데 사용됩니다. 이 세트는 서열의 어느 위치에서 어떤 아미노산으로 변이가 가능한지를 정의합니다. 변이 세트는 설계 템플릿 내 각 잔기의 용매 접근 가능 표면적(SASA)을 계산하여 생성합니다. 잔기가 용매에 50% 이상 노출된 경우, 친수성 아미노산 세트(D, E, G, H, K, N, P, Q, R, S, T)가 허용됩니다. 잔기가 용매에 20% 미만으로 노출된 경우, 소수성 아미노산 세트(A, F, I, L, M, V, W, Y)가 허용됩니다. 잔기의 노출도가 20%에서 50% 사이인 경우에는 모든 아미노산이 허용됩니다. 시스테인은 실험 데이터나 문헌 데이터에서 적절하다고 판단되지 않는 한 일반적으로 변이 세트에서 제외됩니다. 크기가 작은 아미노산(A, G, T)은 일반적으로 모든 변이 세트에 포함됩니다. 가능한 경우, 실험적 또는 문헌적 통찰력을 사용하여 특정 아미노산 위치의 변이 세트를 수동으로 수정할 수 있습니다.

디자인 템플릿 내 서열들의 쌍별 상호작용 에너지를 계산하기 위해 포스필드(forcefield)를 선택합니다. 어떤 포스필드라도 이 프레임워크 내에서 사용되도록 조정될 수 있지만, 두 가지 거리 의존적 포스필드가 개발되어 de novo 디자인 프레임워크에서 광범위하게 사용되고 있습니다. 첫 번째는 고해상도 Cα-Cα 포스필드26로, 거리는 잔기들의 Cα 탄소 사이에서 측정됩니다. 두 번째는 고해상도 센트로이드-센트로이드(centroid-centroid) 포스필드27로, 거리는 잔기들의 센트로이드 사이에서 측정됩니다. 포스필드의 에너지 파라미터는 선형 계획법 파라미터 추정 문제를 해결함으로써 도출되었으며, 이는 대규모 단백질 훈련 세트에 대해 저에너지 고해상도 디코이(decoy)들이 천연 구조보다 에너지적으로 덜 유리해야 한다는 조건을 필요로 했습니다. 고해상도 센트로이드-센트로이드 포스필드와 Cα-Cα 포스필드는 모두 인간 베타-디펜신-2(human beta-defensin-2)에 관한 이전 연구에서 테스트 및 검증되었습니다.17 실제 백본 유연성은 포스필드를 거리 빈(distance bin)으로 이산화함으로써 모델에 통합됩니다. 한 쌍의 아미노산 사이의 거리는 특정 거리 빈에 해당하게 되며, 이는 일정 범위의 거리에 대해 동일한 에너지 값을 부여합니다. 이를 통해 서열 선택 최적화 모델이 백본의 움직임을 고려할 수 있게 됩니다.

전하 제약 또는 함량 제약 형태의 생물학적 제약 조건은 사용자가 추가 설계 입력값으로 직접 포함할 수 있습니다. 전하 제약은 설계된 서열 또는 그 일부에서 충족되어야 하는 특정 전하 또는 전하 범위를 지정합니다. 전하는 양전하 잔기(K 및 R)의 합에서 음전하 잔기(D 및 E)의 합을 뺀 값으로 계산됩니다. 함량 제약은 서열 내 특정 아미노산의 출현 횟수에 대한 상한선과 하한선을 지정합니다. 생물학적 제약 조건은 일반적으로 천연 서열과의 광범위한 서열 정렬을 통해 정의됩니다. 이는 단백질 패밀리에 대해 자연계에 존재하는 전하 및 아미노산 함량의 알려진 생물학적 한계를 반영하기 위함입니다. 추가 제약 조건은 알려진 실험 데이터 분석을 통해 수동으로 정의합니다.

1단계: 서열 선택: 기존의 서열 선택 방법은 Klepeis에 의해 처음 개발되었습니다. 등.15,16 본 방법은 정수 선형 최적화(Integer Linear Optimization, ILP) 모델을 사용하여 디자인 템플릿 내의 에너지에 따라 아미노산 서열을 선택하고 순위를 매깁니다. 이후 이 방법은 강체(단일) 템플릿에 대해 계산 효율성이 더 높은 서열 선택 모델을 도입하여 개선되었으며, 유연한 템플릿을 위한 모델 개발을 통해 확장되었습니다. 이러한 전역 최적화 방법은 무작위 돌연변이에 의존하지 않으며, 이론적으로 전체 서열 공간을 탐색하여 전역 해(global solution)를 결정하는 것이 보장됩니다. 이는 기존의 다른 모든 접근 방식과 비교했을 때 본 접근 방식이 갖는 주요한 장점입니다.

단일 구조 모델: Klepeis et al.15,16에 의해 제안된 서열 선택 모델의 원래 형태는 Fung et al.28에 의해 더욱 정교하게 다듬어졌습니다. 최종 형태는 식 1에 제시되어 있습니다.

방정식, 제약 조건이 포함된 최적화 문제; 수학적 최적화, 기호 표기법.
집합 i=1,...,n은 디자인 템플릿의 잔기 위치를 정의합니다. 각 위치 i에서 돌연변이는 j{i}=1,...,mi로 나타내며, 위치 i가 20가지 천연 아미노산 중 어느 것으로든 돌연변이가 일어날 수 있는 경우 mi=20입니다. k>i인 별칭 집합 k≡i 및 l≡j는 모든 고유한 쌍별 상호작용을 나타내는 데 사용됩니다. 아미노산 돌연변이를 모델링하기 위해 이진 변수 yj 하첨자 i 상첨자 j, 수학적 표기법, 방정식의 변수. 및 1계 도함수 표기법 y'_k, 방정식, 미적분 개념, 교육용 공식.이 도입됩니다. 모델이 위치 i에 아미노산 j를 할당하는 경우 yj 하첨자 i 상첨자 j, 수학적 표기법, 방정식의 변수. 변수는 1의 값을 가지고, 그렇지 않으면 0의 값을 가집니다( 1계 도함수 표기법 y'_k, 방정식, 미적분 개념, 교육용 공식. 역시 마찬가지입니다). 목적 함수는 디자인 템플릿 내 모든 쌍별 에너지 상호작용의 합을 나타냅니다. 아미노산 j가 차지하는 위치 i와 아미노산 l이 차지하는 위치 i 사이의 에너지 상호작용인 파라미터 추상 대수학의 텐서 표기법 예시; 인덱스 표기법을 설명하는 수학적 표현.는 두 위치의 α-탄소 또는 측쇄 중심점 사이의 거리(xi,xj,)와 아미노산 j 및 l의 종류에 따라 달라집니다. 이는 yj 하첨자 i 상첨자 j, 수학적 표기법, 방정식의 변수.와 1계 도함수 표기법 y'_k, 방정식, 미적분 개념, 교육용 공식.가 모두 1일 때만 목적 함수에 기여합니다.

Fung et al.28은 정식화 (1)이 서열 선택을 위한 다른 12가지의 등가 이차 할당 유사 모델보다 계산 효율성이 유의미하게 더 높다는 것을 발견했습니다.28,29 특히, 인간 beta-defensin-2의 두 가지 서열 선택 문제(하나는 복잡도 수준이 3.4x1045이고, 다른 하나는 49개의 추가 선형 생물학적 제약 조건이 포함된 6.4x1037인 경우)에서 Klepeis et al.15,16이 제안한 기존 모델보다 우수한 성능을 보였습니다. Pentium IV 3.2 GHz 프로세서에서 CPLEX 9.030을 사용하여 두 문제를 전역 최적값으로 해결하는 데 Klepeis et al.15,16의 기존 모델은 각각 53,263 CPU sec 및 4,578 CPU sec가 소요되는 것으로 나타났습니다. 반면, 정식화 (1)은 동일한 작업을 수행하는 데 단 649 CPU sec 및 14 CPU sec만이 소요되었으며, 이는 계산 효율성이 각각 82배와 327배 향상되었음을 의미합니다.

가중 평균 모델(Weighted Average Model): Fung et al.28은 설계 템플릿이 유연하여 여러 구조 세트를 포함하는 일반적인 de novo 단백질 설계 사례를 처리하기 위해 두 가지 모델을 개발했습니다. 가중 평균 모델은 단일 구조 모델(식 1)의 에너지 파라미터 추상 대수학의 텐서 표기법 예시; 인덱스 표기법을 보여주는 수학식.(xi,xk) 대신 가중 평균 에너지 정적 평형 공식 ΣE_ik^jl(x_i,x_k)wt(x_i,x_k,d) 방정식, 수학적 개념.를 사용합니다. 가중치 wt(xi,xk,d)는 템플릿 구조에서 xi와 xk 사이의 거리가 거리 빈 d에 속하는 빈도에 의해 결정됩니다. 가중 평균 모델의 최종 형태는 식 2에 제시되어 있습니다.

최적화 문제 방정식; 선형 계획법 모델; 제약 조건 및 이진 변수; 수학적 공식화.
거리 빈 모델(Distance Bin Model): 유연한 템플릿 구조를 위한 두 번째 서열 선택 모델은 이진 변수 bikd를 도입하여 다중 구조로부터 거리 정보를 통합합니다. 이 변수는 xi와 xk 사이의 거리가 거리 빈 d에 속하는 경우 1이며, 그렇지 않으면 0입니다. 도입된 또 다른 매개변수인 disbin(xi, xk, d)는 템플릿 구조 중 어느 하나에서 xi와 xk 사이의 거리가 거리 빈 d에 속하는 경우 1이며, 그렇지 않으면 0입니다. 아미노산 쌍당 단 하나의 거리 빈만이 총 에너지에 기여하므로, 목적 함수 내의 추상 대수학의 텐서 표기법 예시; 인덱스 표기법을 설명하는 수학적 표현.는 수학 방정식 Σ E(x) 다이어그램; 정적 평형, 연구 분석을 위한 합계 공식.로 대체됩니다. 그러나 이는 목적 함수에 비선형성을 유발합니다. 모델의 선형화 및 실행 가능성을 위해 추가해야 할 제약 조건에 대한 자세한 내용은 Fung et al.28에서 확인할 수 있습니다. 거리 빈 모델은 식 3에 제시되어 있습니다.

최적화 문제 방정식; 선형 계획법 모델; 제약 조건 및 이진 변수; 수학적 공식화.
위와 같이 공식화된 정수 선형 계획법(Integer Linear Programming, ILP) 문제15-17는 분기 한정법(branch-and-bound techniques)을 사용하여 엄밀하게 해결할 수 있습니다.28-30 이러한 기법은 전역 최소 에너지 서열로의 일관되고 신뢰할 수 있는 수렴을 보장합니다.

2단계: 검증: 그림 2는 2단계의 두 가지 접근 방식에 대한 상세한 개요를 제공합니다. 이 그림은 최종 순위 지표를 계산하는 데 필요한 단계와 각 단계에서 생성된 구조의 수를 보여줍니다.

폴딩 특이성(Fold Specificity): 폴딩 특이성은 1단계에서 도출된 예비 설계안들의 순위를 매기기 위해 사용되는 지표입니다. 이 계산의 목적은 에너지 계산을 기반으로, 템플릿 구조의 원래 서열과 비교하여 각 서열이 해당 템플릿 구조로 얼마나 잘 폴딩되는지를 확인하는 것입니다. 이를 수행하는 방법에는 두 가지 접근 방식이 있으며, 각 방식은 서로 다른 계산 자원을 요구합니다.

첫 번째 접근 방식은 Klepeis et al.15,16에 의해 구현되었습니다. 이 방식은 결정론적 전역 최적화(deterministic global optimization)를 기반으로 하는 단백질 구조 예측 프레임워크인 ASTRO-FOLD26,27,31-47를 활용합니다. 이 방식은 계산 비용이 매우 높기 때문에 현재 Protein WISDOM의 구현에는 사용되지 않고 있습니다. 계산 리소스의 제한과 설계 과정에서 수백에서 수천 개의 서열에 대해 이 계산을 수행해야 할 필요성을 인식하여, Fung et al.17은 TINKER/CYANA48-50를 이용한 더 효율적인 접근 방식을 제안했습니다. 이 방식은 구조의 유연한 템플릿(flexible template)을 정의하는 것을 포함합니다. 유연한 템플릿은 Cα 원자 간의 거리뿐만 아니라 잔기의 ϕ 및 ψ 각도에 대한 상한 및 하한 값을 사용하여 정의할 수 있습니다. 단일 구조의 경우, 초기 거리와 이면각이 사용되며 경계값은 고정 거리 또는 백분율로 정의됩니다. 기본 경계값은 Cα 거리의 경우 ±10%, 이면각 경계값의 경우 ±10°입니다. 유연한 템플릿의 경우, 설계에 입력된 모든 템플릿 구조에서 관찰된 최대 및 최소 값으로부터 경계값을 얻을 수 있습니다. 각 서열에 대해 초기 경계값이 정의되면, CYANA 2.148,49을 사용하여 수백 개의 컨포머(conformer)를 포함하는 앙상블이 생성됩니다. 컨포머는 CYANA의 비틀림 각도 역학 모의 담금질(torsion angle dynamics simulated annealing) 프로토콜을 사용하여 생성되며, 이는 단백질을 빠르게 가열한 후 천천히 냉각하면서 샘플링된 컨포메이션을 추적합니다. 모의 담금질 후에는 Van der Waals 반경 중첩으로 인한 충돌과 거리 및 각도 제약 조건의 위배 사항을 최소화하는 국소 에너지 최소화(local energy minimization)가 수행됩니다. 기본적으로 500개의 최종 구조가 생성됩니다. 각 서열의 앙상블에 포함된 각 구조는 AMBER 포스필드51를 사용하여 TINKER 3.650에서 국소 최소화를 거칩니다. 최소화된 각 구조의 최종 위치 에너지가 표로 작성됩니다. 이 전체 접근 방식은 시작 서열뿐만 아니라 각 후보 돌연변이 서열에 대해서도 수행됩니다. 그런 다음, 다음의 볼츠만 분포(Eq. 4)를 사용하여 야생형 서열 대비 각 돌연변이 서열의 표적 폴드에 대한 폴드 특이성(Fold Specificity)을 계산할 수 있습니다.

천연 및 신규 상태에 대한 정적 평형 방정식 Σ(e^(-βEi)); 수학 공식.
근사 결합 친화도: 근사 결합 친화도 계산 방법은 표적 단백질과 복합체를 형성하는 설계된 서열들의 순위를 매기는 데 사용됩니다. 이러한 계산은 1단계에서 얻은 서열에 직접 수행하거나, 폴드 특이성 단계에서 얻은 고폴드 특이성 서열들에 대해 수행할 수 있습니다.

Lilien et al.52은 단백질-리간드 복합체의 근사 결합 친화도를 계산하는 방법을 제안했다. 이 방법은 단백질, 리간드 및 단백질-리간드 복합체의 로타머 기반 앙상블을 생성하고, 해당 앙상블을 사용하여 분배 함수를 계산하는 방식에 기반한다. 이러한 근사 결합 친화도는 K*로 표기하며 식 5로 정의된다.

여기에 q광혈판(Photodynamic Therapy, PDT) 단백질-리간드 복합체의 분배 함수이며, qb 자유 단백질의 분배 함수이며, qL 자유 리간드의 분배 함수입니다. 분배 함수는 식 6에 정의되어 있으며, 여기서 집합들은 B, F 그리고 L 각각 결합된 단백질-리간드 복합체, 자유 단백질 및 자유 리간드의 로타머 기반 컨포메이션을 포함합니다. En 컨포메이션 에너지(conformation energy)는 n, R 기체 상수는, 그리고 T 온도입니다.

Thermodynamic equilibrium equations; Σe^(-Eb/RT); scientific formula for internal energy.
구조 예측: 계산을 시작하려면 K* 각 서열의 3D 구조가 필요합니다. 이는 Rosetta AbRelax 함수를 사용하여 수행됩니다.53-55 Rosetta 3.4 소프트웨어 패키지의 일부입니다. AbRelax 알고리즘의 전략은 단백질의 국소 구조가 단백질의 국소 서열에 의해 영향을 받지만, 전적으로 결정되지는 않는다는 실험적 관찰에 근거합니다. 몬테카를로 알고리즘을 사용하여 국소 단백질 구조를 서열 유래 구조적 단편으로 교체합니다. 이 방법은 매몰된 소수성 잔기, 쌍을 이룬 β-스트랜드 및 특이적 측쇄 상호작용과 같은 비국소적 상호작용을 고려한 최종적인 조밀한 단백질 구조를 생성합니다.

클러스터링: AbRelax에서 얻은 구조들은 OREO를 사용하여 φ 및 ψ 각도에 따라 클러스터링됩니다.56,57 이러한 클러스터링 방법은 전체 구조 앙상블의 대표적인 백본 구조를 규명합니다. 가장 큰 10개 클러스터의 평균 구조와 전체에서 에너지가 가장 낮은 구조를 표적 단백질 도킹을 위해 선택합니다. 이를 통해 각 펩타이드 서열에 대해 11개의 고유한 백본 구조가 제공되며, 앙상블 생성 과정에 백본 유연성이 통합됩니다.

도킹 예측: 도킹 예측은 RosettaDock을 사용하여 수행한다.58-60 각 서열에 대해, 11가지 펩타이드 백본 구조 각각을 표적 단백질에 도킹시킨다. 이 경우, 결합 부위가 알려져 있으므로 펩타이드를 결합 부위 근처에 배치하고 결합 부위에 수직으로 3 Å, 평행하게 8 Å 이동 및 8° 회전이 가능하도록 설정한다. RosettaDock은 저해상도 및 고해상도 도킹 이동을 위해 몬테카를로 알고리즘을 사용한다. 각 도킹 실행 시 복합체 구조의 대규모 앙상블이 생성된다. 11번의 실행 각각에서 에너지가 가장 낮은 10개의 복합체를 최종 로타머 기반의 컨포메이션 앙상블 생성 시 시작 구조로 사용한다(서열당 110개의 시작 구조).

최종 앙상블 생성: RosettaDesign61은 fixbb 함수를 통해 side chain의 rotamer만 조정함으로써 다수의 구조를 생성할 수 있으므로, 최종 rotamer 기반의 conformation ensemble을 생성하는 데 사용됩니다. RosettaDesign에 다수의 시작 구조가 제공되면, 각 구조에 대해 잔기가 무작위로 선택되고 Monte Carlo 알고리즘을 통해 rotamer가 변경됩니다. 이 과정은 수천 번의 rotamer 치환이 시도될 때까지 반복되며, 결과적으로 partition function에 크게 기여하는 최종 저에너지 conformation을 생성합니다.

펩타이드 앙상블을 생성하기 위해, 가장 큰 10개 클러스터 각각에서 에너지 수준이 가장 낮은 10개의 펩타이드 구조와 전체에서 에너지가 가장 낮은 10개의 펩타이드 구조를 RosettaDesign의 시작 구조로 사용합니다(총 110개의 시작 구조). 각 시작 구조에 대해 200개의 로타머 컨포머(rotamer conformers)를 생성하여 최종적으로 22,000개의 구조로 이루어진 앙상블(식 6의 세트 L)을 구축합니다. 이 앙상블에는 백본 유연성과 로타머 유연성이 모두 반영됩니다.

복합체 앙상블은 도킹 예측 단계에서 얻은 110개의 시작 구조를 사용하여, 각 시작 구조당 200개의 로타머 컨포머를 생성함으로써 유사하게 생성됩니다. 최종 앙상블 크기는 22,000개의 구조(식 6의 세트 B)입니다. 유연성은 사용된 다양한 펩타이드 백본 구조, 다양한 도킹 컨포메이션, 그리고 각 시작 구조에 대한 로타머 컨포머를 통해 고려됩니다.

단백질 앙상블은 대상 단백질 구조에 대해서만 RosettaDesign을 실행하여 생성합니다. 이 경우, 단일 시작 구조에 대해 2,000개의 로타머(rotamer) 컨포메이션이 생성되므로, 최종 앙상블 크기는 2,000개의 구조가 됩니다(식 6의 F 값으로 설정).

단백질 WISDOM

Protein Workbench for In Silico De novo design Of bioMolecules의 약자인 Protein WISDOM은 학계가 당사의 de novo 단백질 설계 프레임워크를 사용자 친화적인 방식으로 이용할 수 있도록 지원하는 온라인 도구입니다. 이 도구는 단일 단백질 체인이 템플릿 폴드를 형성하도록 설계하는 것부터 타겟 단백질에 결합하는 새로운 펩타이드를 설계하는 것에 이르기까지, 흔히 접하는 여러 설계 목적을 처리할 수 있습니다. 다음 두 섹션에서는 주로 발생하는 두 가지 유형의 단백질 설계 문제에 대한 Protein WISDOM의 기능을 설명합니다. 첫 번째 유형은 서열 선택을 통해 주어진 설계 템플릿에서 유리한 새로운 서열을 선택한 다음, 폴드 특이성을 사용하여 해당 새로운 서열을 검증하는 방식입니다. 두 번째 유형은 서열 선택을 통해 복합체 내에 결합된 펩타이드의 새로운 서열을 선택한 후, 폴드 특이성과 근사 결합 친화도 계산을 모두 사용하여 새로운 서열을 검증하는 방식입니다.

사용자 등록

http://www.proteinwisdom.org에서 Protein WISDOM 웹 페이지를 방문하십시오.

페이지 우측 상단의 사용자 로그인 버튼을 클릭하십시오. 등록하려면 "여기 클릭"을 누르십시오.

이메일 주소 및 요청하는 사용자 이름 관련 정보를 입력하고 계속하기를 클릭하십시오.

성함, 소속 기관, 연구 그룹, 주소 등 추가 정보를 입력하십시오. 이용 약관 동의 체크박스를 클릭하십시오. "등록 제출" 버튼을 클릭하십시오.

1단계: 서열 선택

단백질 서열 및 템플릿 구조 제출

단백질 설계 실험을 시작하려면 사용자 로그인 버튼을 클릭하십시오. 사용자에게는 제출한 작업 수, 업로드한 구조(템플릿) 수, 그리고 지금까지 업로드한 구조 목록이 표시되는 "사용자 홈페이지"(그림 3)가 나타납니다.

"Create New Job"를 클릭하여 새로운 설계 작업을 시작합니다. 그러면 사용자는 "Job Submission" 페이지로 이동합니다(Figure 4). 작업 이름을 입력하고, 이전 작업에 기반한 것인지 여부를 표시하십시오(i.e. 동일한 설계 템플릿, 돌연변이 세트 및 생물학적 제약 조건을 새 작업으로 가져올 수 있으며, 사용자는 돌연변이 세트와 생물학적 제약 조건을 수정할 수 있습니다). "continue"를 클릭하십시오.

설계 템플릿의 단백질 구조를 업로드하십시오(그림 5). 이 템플릿은 표준 단백질 데이터 은행(PDB) 형식이어야 합니다. 모든 원자에 대해 하나의 좌표 세트를 갖는 강체 템플릿(rigid template)이거나, NMR 용액 구조에서 얻은 것과 같이 여러 모델을 포함하는 유연한 템플릿(flexible template)일 수 있습니다. 단일 단백질을 설계하는 경우, 템플릿에는 오직 하나의 체인만 포함될 수 있습니다. 사용자는 새 템플릿을 업로드하거나 이전에 업로드한 기존 템플릿 중에서 선택할 수 있습니다. 가능한 경우, 선택적으로 템플릿의 PDB ID를 지정하십시오. 여러 개의 템플릿을 업로드하는 경우, 각 모델이 "MODEL #"로 시작하고 "ENDMDL"로 끝나는지 확인하십시오. 모든 잔기가 천연 아미노산으로 지정되었는지 확인하십시오. "Continue"를 클릭하십시오.

템플릿 업로드가 성공하면, Protein WISDOM은 템플릿에서 찾은 잔기, 체인 및 모델의 수를 표시하고 서열을 나열하며 사용자에게 템플릿 확인을 요청합니다. 템플릿 구조가 올바르게 입력되었는지 확인한 후 "Continue"를 클릭하십시오.

템플릿이 성공적으로 업로드되고 확인되면, 사용자는 "메인 제어 페이지"(Main Control Page)로 이동하게 됩니다.그림 6). 이 페이지에서 사용자는 작업 상태를 확인하고, 돌연변이 세트 및 생물학적 제약 조건을 수정하며, 1단계: 서열 선택을 위해 작업을 제출할 수 있습니다. 현재는 1단계가 완료되지 않았으므로 2단계에 대한 옵션이 제공되지 않습니다. 해당 옵션들은 1단계 결과가 도출되면 나타납니다.

돌연변이 세트의 선택

"메인 컨트롤 페이지"에서 "Mutation Sets" 링크를 클릭하여 변이 세트를 정의하십시오.

돌연변이가 허용될 잔기를 선택하고, 해당 잔기가 어떤 아미노산으로 돌연변이 될 수 있는지 선택하십시오 (그림 7). 기본적으로, 특정 위치에서 허용 가능한 아미노산은 용매 접근 가능 표면적(SASA)을 기준으로 선택됩니다. 돌연변이 세트가 필요합니다.

변이 세트를 선택한 후 "Save Changes"를 클릭하십시오. 사용자는 변이 세트 편집을 계속할 수 있습니다. 변이 세트 편집을 마쳤으면, 클릭하여 "Main Control Page"로 돌아가십시오.

생물학적 제약 조건의 선택

생물학적 제약 조건을 정의하려면 "메인 제어 페이지"에서 "Biological Constraints" 링크를 클릭하십시오.

단백질 전체 또는 일부 영역에 대해 전하 또는 아미노산 함량 제약 조건을 지정하십시오(그림 8).

필요한 경우, 발생 가능한 총 돌연변이 수를 제한하십시오. 생물학적 제약 조건 설정은 선택 사항입니다. 완료 후 클릭하여 "메인 제어 페이지"로 돌아가십시오.

1단계 제출: 서열 선택

"Begin Stage 1" 링크를 클릭하여 사용자를 "Submit Stage 1" 페이지로 이동시킵니다.

설계할 체인을 선택하십시오 (그림 9), 생성할 서열 수, 거리 의존적 힘장 및 모델을 선택합니다. 복합체를 설계하며 폴드 특이성(Fold Specificity) 계산을 원하는 경우, 설계할 단일 체인만 선택해야 합니다. 업로드한 템플릿이 단일 구조이거나 "강체 템플릿(rigid template)"인 경우에는 Single Structure 모델만 사용할 수 있습니다. 업로드한 템플릿이 유연한 경우에는 Single Structure, Weighted Average, Distance Bin의 세 가지 모델 중에서 선택할 수 있습니다. 해결해야 할 최적화의 계산 복잡성을 고려하십시오. 상한선은 20입니다.25 허용되는 계산 복잡도를 위해.

작업을 제출하십시오. 사용자는 "메인 제어 페이지"(Main Control Page)로 다시 이동하게 됩니다.그림 10작업 상태(Job Status)는 작업의 현재 진행 상황을 나타내도록 업데이트됩니다. 제출 후에는 해당 작업의 편집이 제한됩니다.

작업이 완료되면 사용자는 설계된 서열 목록이 포함된 결과 이메일을 받게 됩니다. 결과는 "Main Control Page"에서도 확인할 수 있습니다. 사용자가 이 검증을 수행할 수 있도록 페이지에 Stage 2: Fold Specificity를 위한 상자가 나타납니다.

두 번째 단계: 배수 특이성 계산

접힘 특이성 제출

"Begin Stage 2: Fold Specificity"를 클릭하여 "Build Stage 2" 페이지로 이동합니다. 템플릿 유연성 인자(Template flexibility factor)를 거리의 백분율 또는 고정 거리로 지정하여 Cα-Cα 거리의 상한 및 하한 범위를 정의합니다. 템플릿 유연성 인자를 백분율로 지정하여 φ 및 ψ 이면각의 상한 및 하한 각도 범위를 정의합니다. 유연한 템플릿을 사용할 때 상한 및 하한 거리 범위는 모든 템플릿 모델 전체에서 가장 낮고 높은 거리 값으로 설정된다는 점에 유의하십시오. 마찬가지로, 상한 및 하한 각도 범위는 모든 모델 전체에서 가장 높고 낮은 각도 값으로 설정됩니다.

"Submit" 버튼을 클릭하십시오.

시퀀스당 생성할 구조 수를 지정하고 "Continue"를 클릭하십시오. 시퀀스당 생성 가능한 구조의 최대 한도는 500개입니다.

폴드 검증 제출 의사를 확인하려면 "계속"을 클릭하십시오. 1단계와 2단계는 2단계가 완료될 때까지 편집이 제한됩니다.

작업이 완료되면 결과가 포함된 이메일이 사용자에게 전송됩니다. Protein WISDOM의 "Main Control Page"에서 결과를 확인하십시오(그림 11). 여기에서 설계된 서열, 1단계의 해당 에너지 값 및 2단계의 접힘 특이성 값이 포함된 텍스트 파일을 확인하고 다운로드할 수 있습니다. 또한, 사용자는 "View Results" 링크를 클릭하여 1단계 순위와 에너지 값, 2단계 순위 및 접힘 특이성 값이 포함된 표를 브라우저에서 확인할 수 있습니다.

3단계: 단백질-펩타이드 복합체의 근사 결합 친화도 계산

근사 결합 친화도(Approximate Binding Affinity) 계산을 통해 설계된 리간드 단백질/펩타이드와 나머지 복합체 간의 친화도를 계산합니다. 이 계산은 1단계 직후 또는 폴드 특이성(Fold Specificity) 계산이 완료된 후에 수행할 수 있습니다.

"Sequence #"를 클릭하여 근사 결합 친화도 계산을 시작할 서열을 선택하십시오. 사용자는 설계된 서열 목록과 함께 서열 선택 및 폴드 특이성 순위가 표시되는 "Select Sequence" 페이지로 이동하게 됩니다. 계산 과정에서 연산 부하가 매우 크기 때문에, 근사 결합 친화도 계산을 위해 한 번에 하나의 서열만 선택할 수 있습니다. 특정 서열의 계산이 완료되면 사용자는 다른 서열을 선택하여 근사 결합 친화도를 계산할 수 있으며, 이 결과는 이전 결과에 추가되어 완료된 모든 서열에 대한 근사 결합 친화도를 표시합니다. 서열을 선택하고 저장하면 사용자는 "Main Control Page"로 다시 이동합니다.

작업을 제출하려면 "Begin Stage 2: Approximate Binding Affinity"를 클릭하십시오. 작업이 완료되면 결과가 사용자에게 이메일로 전송되며, 여기에는 서열 번호, 근사 결합 친화도 및 식 6의 분배 함수 값이 포함된 첨부 파일이 포함됩니다. 이후의 모든 근사 결합 친화도 작업에 대해, 이 파일에는 완료된 모든 서열에 대한 결과가 포함됩니다. 전체 결과(서열 선택, 폴딩 특이성 및 근사 결합 친화도)는 해당 작업의 "Main Control Page"에 접속하여 확인할 수 있습니다(그림 12).

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결과

HIV-1 진입 억제제의 De Novo 설계

Protein WISDOM에 구현된 de novo 설계 프레임워크는 여러 중요한 치료 시스템을 위한 억제 펩타이드 설계에 사용되었습니다(표 1 및 2). 주목할 만한 시스템 중 하나는 호스트 세포 수용체인 CD4로의 HIV-1 진입을 억제하는 펩타이드 설계이며, 본에서는 Protein WISDOM 인터페이스의 실질적인 사용법을 입증하기 위한 대표 시스템으로 활용됩니다. 이 펩타이드들은 호스트 T 도움 세포로의 HIV-1 융합 및 진입의 핵심 역할을 하는 막관통 서브유닛 gp41을 표적으로 설계되었습니다. 결과가 원본 논문에 제시된 것과 반드시 동일하지는 않을 수 있음에 유의하십시오. 이는 본 방법의 이 단계에서 사용된 Rosetta 방법의 확률적 특성과 원본 논문 발표 이후 Rosetta2.3에서 Rosetta3.4로의 업데이트로 인한 것입니다.

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토론

de novo 단백질 설계 프레임워크는 서열 선택 단계와 검증 단계의 두 단계로 구성됩니다. 이 프레임워크는 견고하고 유연한 설계 템플릿을 처리할 수 있을 만큼 견고하며 단일 단백질 설계 또는 복잡한 단백질 설계에 적용할 수 있습니다. 이 프레임워크는 수십 가지 질병에 적용되는 수많은 단백질 시스템에 성공적으로 적용되었습니다. 많은 디자인이 실험적으로 검증되어 현재까지 발견된 일부 단백질의 가장 강력한 억제제 또는 작용제를 제공합니다. 이 프레임워크는 이제 Protein WISDOM을 통해 학계에서 사용할 수 있습니다.

이 방법에는 세 가지 중요한 단계가 있습니다. 첫 번째는 단백질 설계를 위한 글로벌 최적화 기술을 사용하는 서열 선택 단계입니다. 단백질 설계 문제는 매우 복잡한 문제입니다(n개의 돌연변이 가능한 위치에 대해 20개의 가능한 서열). 이 숫자는 실험 설계 방법으로 고려할 수 있는 가능한 시퀀스 수보다 훨씬 높습니...

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공개 사항

저자는 경쟁하는 금전적 이해관계가 없음을 선언합니다.

감사의 글

CAF는 NSF, NIH의 지원에 감사를 표합니다(R01 GM52032; R24 GM069 736) 및 미국 환경 보호국, EPA(R 832721-010)에서 확인할 수 있습니다. 이 연구의 일부는 DoD, Air Force Office of Scientific Research의 정부 지원으로 가능했습니다. JS는 NIH (P50GM071508-06)의 지원에 감사드립니다. MLBP는 NDSEG(National Defense Science and Engineering Graduate) 펠로우십, 32 CFR 168a의 지원에 감사드립니다. GAK는 보조금 번호 DGE-1148900으로 National Science Foundation 대학원 연구 펠로우십의 지원에 감사드립니다.

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