레이저 유도 축삭 병변 동안 긴장 릴리스의 측정 Piconewton 및 밀리 초 단위의 해상도로 기판에 축삭 접착을 평가하는

요약

우리는 부분적으로 축삭의 세포막에 부착 광학적 포획 프로브에서 수행 동시 힘 분광 측정으로 레이저 해부학자로 lesioned 된 축삭의 긴장 방출을 측정 하였다. 개발 된 실험 프로토콜은 문화 기판에 축삭 접착력을 평가합니다.

초록

개발 신경 네트워크 기능 연결의 형성은 외부의 신호에 의해 영향을 받는다. 개발 신경 세포의 신경 돌기 성장은 화학적 및 기계적 신호에 따라, 그리고 메커니즘을하는 기계적인 신호는 감지 및 응답을 제대로 이해하고 있습니다. 세포의 성숙에 힘의 역할을 해명하는 것은 기판에 세포 부착 및 세포 구조 커플 링을 홍보 할 수있는 발판의 디자인을 활성화하고 따라서 부상 후 재생하는 다른 신경 세포 유형의 능력을 향상시킬 것입니다.

여기, 우리는 레이저에 의한 세포 병변 동안 동시 힘 분광 측정을 적용하는 방법을 설명합니다. 우리는 축삭의 세포막에 부착 광학적 포획 프로브의 동시 간섭 추적에 의해 부분적으로 lesioned 축삭의 긴장 방출을 측정합니다. 우리의 실험 프로토콜은 piconewton 감도와 긴장의 방출을 감지하고의 긴장 릴리스의 동적밀리 초 시간 해상도. 따라서 세포와 기질 사이의 기계적인 결합이 약물 치료 및 / 또는 기판의 독특한 기계적 특성에 의해 조절 될 수있는 방법을 연구하는 고해상도 방법을 제공합니다.

서론

광학 현미경은 살아있는 세포를 관찰 할 수있는보다 적게 침략 이미징 시스템 중 하나입니다. 이러한 방사 압력 (광학 핀셋 ^1에서와 같이), 또는 고 에너지 광자 플럭스 (레이저 해부 ² 등) 등의 효과의 착취,이 기술은 나노 조작으로 확장되었다. 광학 이미징 시스템은 ^3을 시각화하고 하위 표적 세포를 조작하는 정밀한 제어를 비치한다. 동시에, 전달 된 레이저 출력의 정확한 교정 덕분에, 광학 도구는 전례없는 재현성도 부드럽거나 침입 샘플 조작을 수행.

여러 실험실 다른 세포는 ⁵ 융합하거나, 광학적으로 구동화물 ^6,7에 의해 세포를 자극하는 세포 소기관 ^4, 브레이션하기 위해 동일한 실험 장치, 광학 핀셋 및 레이저 해부에 통합됩니다. 광 핀셋, 광 강도의 보정 후를 허용하면서piconewton 규모의 셀에 적용되는 힘의 제어, 레이저 박리 시스템은 막 사진 por​​ation에서 하위 세포 구조의 단일 세포 기관 또는 박리 절제 범위는 광학 조작, 조절 할 수 있습니다. 그러나 레이저 해부 교정은 주로 시편 ⁸ 인한 형태 학적 변화를 설명하는 이미지 분석을 기반으로 샘플 공급 에너지에 대하여 광학 조작....

프로토콜

1. 광 설치

전체 광학 시스템은 이전 ¹⁵ 설명했다. 간단히, 광 핀셋 시스템은 1064 nm의 (IPG 레이저 GmbH의)에서 이테르븀 연속파 (CW) 광섬유 레이저 운영을 기반으로합니다. 공간 광 변조기 (SLM) (LCOS-SLM 모델 X10468-07 - 하마 마츠) 컴퓨터 생성 홀로그램하여 배양 접시에 포획 초점 반점의 위치를​​ 제어하는​​ 수신 IR 레이저 빔의 위상을 다릅니다. 자유롭게 사용할 수있는 블루 핀셋 소프트웨어 (장비 테이블에 웹 링크)가 생성 홀로그램은 공간 광 변조기에 투사. 와 포토 다이오드 (PD, PDA100A-EC - THORLABS) - 힘 분광 측정을위한 간섭계는 4 사분면 다이오드 (하마 마츠 C5460SPL 6041 보드 QPD, S5980)에 근거했다.

355 nm의 (- 가득 찬다 포토닉스 PNV-001525-040, 파워 칩 나노 펄스 UV 레이저)에서 YAG 레이저 : 레이저 해부 소스 펄스 서브 나노초 UV 노스 다코타이었다. 음향광 변조기 (MQ110-A3-UV, 실리카-AA-옵토 - 전자 융합 355 nm의)는 시료에 전달 UV 레이저의 힘을 통제했다.

현미경의 o....

결과

세포는 초점 유착에 의해 기판에 견인 힘을 생성합니다. 세포 골격 요소에 의해 생성 된 힘은 문화 기판의 반작용 힘 평형에 있습니다. 신경 돌기의 레이저 유도 병변 후, 긴장된 골격 케이블 중 일부는 중단되고 기판 접착의 반대 힘이 제거되기 때문에 해당 평형 장력이 해제됩니다. 출시 긴장 부분적으로 영향을받지 초점 유착에 배포하고, 광학 트랩에서 개최 세포막에 부착 구슬 (회로도 그림 1 참조) 기판에 셀을 고정 골격 요소에 의해 상쇄되지 같은 릴리스의 부분을 측정합니다 .

우리는 그림 2, 상술 한 실험 프로토콜의 대표적인 결과에보고합니다. 신경 세포는 그림 2a 왼쪽 패널에서 차별화 N의 축삭을 식별하는 긴 신경 돌기를 제공합니다EURON. 그림 2a 오른쪽 패널에서 동일한 신경 세포가 유도 축삭 병변 (흰색 화살표로 표시) 한 후 표시됩니다.

토론

우리는이 연구에서 레이저 유도 세포 병변 동안 동시 힘 분광 측정을 수행하여 문화 기판에 돌기 접착력을 비교하는 정량 방법을보고합니다. 긴장의 측정 자료는 기판 세포의 부착 정도와 관련되어 초점 유착의 높은 숫자를 가진 세포는 덜 긴장을 해제해야합니다. piconewtons의 측면에서 긴장의 방출을 측정하는 것은 서로 다른 실험 조건 ¹⁴ 문화 지원에 축삭 접착력을 평가하는 물리적 인 양을 제공합니다.

여러 실험실 독특한 광학 디자인에게 ^23을 채택, 광 핀셋 시스템과 레이저 해부를 통합. 우리의 선택은 고정 된 광학 경로 및 현미경 스테이지 모션 설정했다. 이를 위해, 우리는 UV 레이저의 위치와 관련하여 트래핑 자리를 이동하는 IR 레이저 빔 경로에 공간 광 변조기를 소개합니다. 하지만 galvanometrIC 거울 샘플을 이동하지 않고 레이저 초점의 위치를​​ 조종 할 수, 그들은 힘 분광 측정에 영향을 미치는 시스템에 기계적 소음.......

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
REAGENTS
Polymer microspheres, 4 μ m, COOH 코팅	Bangs laboratories	PC05N/6700
PolyLink 단백질 커플링 키트	Polyscience	19539
EQUIPMENT
IR 레이저	IPG Laser GmbH	YLM-5-SC-LP	이테르븀 연속파(CW) 파이버 레이저, 선형 편광 포함
공간 광 변조기	Hamamatsu	LCOS-SLM 10468-07
블루 핀셋 소프트웨어	광학 그룹, 글래스고 대학교	무료 다운로드 소프트웨어	http://www.physics.gla.ac.uk/Optics/projects/tweezers/slmcontrol/
ImageJ	Hamamatsu	무료 다운로드 소프트웨어	http://rsbweb.nih.gov/ij/
QPD	Thorlabs	S5980 with C5460SPL 6041 보드	x, y 트랩 프로브 변위를 측정하는 4개의 사분면 포토다이오드
PD	Teem Photonics	PDA100A-EC	포토다이오드 z 트랩 프로브 변위를 측정하기 위해
나노 펄스 UV 레이저	AA-optoelctronics	PNV-001525-040	펄스 UVA 레이저, 펄스 길이 400ps
음향 광학 변조기	Olympus	MQ110-A3-UV, 355nm 융합 실리카
정립 현미경	Andor	BX51	60, 0.9 NA, 수침 대물
CCD Warner	Instruments	V887ECSUVB EMCCD
펠티에 장치	Physic Instruments	QE1 저항 가열 TC-344B 이중 채널 히터 포함 컨트롤러
현미경 스테이지 : 마이크로 + 피에조 스테이지	National Instruments	3 개의 선형 스테이지 M-126. 별도의 3축 압전 나노 포지셔닝 스테이지를 탑재한 CG1 P-733.3DD
Daq		NI PCI-6229	트랩된 프로브의 x, y, z 위치를 획득하고 피드백 루프 신호를 현미경 스테이지로 전송
Linux RTAI(Real Time Application Interface) 기계			실시간 피드백 루프 시스템, 스테이지 위치 제어를 위해 전용 PC 데스크탑에서 개발

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