약하게 산란 주제의 디지털 인라인 홀로그램 현미경 (DIHM)

요약

약하게 산란 물체의 3 차원 위치를 고유 표준 현미경에 사소한 변형을 수반 인라인 디지털 홀로그램 현미경 (DIHM)를 사용하여 식별 될 수있다. 우리의 소프트웨어는 삼차원 위치 및 미세한 위상 객체의 형상을 수득 레일리-펠드 역 전파 결합 촬상 간단한 휴리스틱을 사용한다.

초록

이러한 작은 콜로이드 입자와 대부분의 생물 세포와 같은 약한 산란 개체는 자주 현미경에서 발생된다. 실제로, 기술의 범위는 더 이러한 위상 객체를 시각화하기 위해 개발되었다; 위상차와 DIC는 콘트라스트를 향상시키기위한 대중적인 방법들이다. 그러나, 밖으로의 영상 평면 방향의 기록 위치와 모양은 도전 남아 있습니다. 이 보고서는 정확하게 인라인 디지털 홀로그램 현미경 (DIHM)를 사용 위치와 입체적 오브젝트 지오메트리를 결정하기 위해 간단한 실험 방법을 소개한다. 대체로, 액세스 가능한 샘플 볼륨은 횡 방향으로 카메라 센서의 크기, 그리고 축 방향으로 상기 조명 간섭에 의해 정의된다. 일반 샘플 볼륨은 LED 조명을 사용하여 200 ㎛ X 200 ㎛ × 200 μm의에서 범위5mm × 5 ㎜ × 5 ㎜ 이상의 레이저 조명을 사용. 평면파가 시료에 입사되도록이 조명광 구성된다. 샘플 볼륨의 개체는 다음 조명 방향에 수직 인 간섭 패턴을 형성하도록 unscattered 광과 간섭하는 빛을 산란. 이 이미지 (홀로그램) 삼차원 재구성에 필요한 깊이 정보를 포함하고, 이러한 CMOS 또는 CCD 카메라와 같은 표준 촬상 장치에서 캡처 할 수있다. 레일리-펠드 위로 전파 방법은 수치 현미경 이미지를 집중할 채용하고 GOUY 위상에 근거 간단한 촬상 휴리스틱은 변칙 재구성 된 볼륨 내의 개체 산란 식별하기 위해 사용된다. 이 간단하지만 강력한 방법은 미세한 샘플에있는 객체의 위치와 모양의 명확한 모델이없는 측정 결과.

서론

디지털 인라인 홀로그램 현미경 (DIHM)은 수영과 같은 미생물 ^1,2 및 표준 현미경 설치에 최소한의 수정 부드러운 물질 시스템 ^3,4, 같은 미세한 샘플의 빠른 3 차원 화상을 할 수 있습니다. 본 논문에서는 DIHM의 교육적 데모는 우리의 실험실에서 개발 된 소프트웨어를 중심으로 제공된다. 이 논문은, 현미경을 설정 데이터 수집을 최적화 및 3 차원 데이터를 재구성하기 위해 촬영 한 이미지를 처리​​하는 방법에 대한 설명이 포함되어 있습니다. 예 이미지 (DG 그리어 등 ^(5)에 의해 개발 된 소프트웨어에 부분적으로 기반) 소프트웨어는 우리의 웹 사이트에 자유롭게 사용할 수 있습니다. 설명은 현미경을 구성 홀로그램으로부터 입체 볼륨을 재구성 및 소프트웨어 패키지를 추적 자유로운 선을 사용하여 그 생성 된 볼륨을 렌더링하기 위해 필요한 단계가 제공된다. 신문은 재건의 품질에 영향을 미치는 요인에 대한 논의와 결론한 경쟁 방법에 DIHM의 비교.

DIHM이 (김 ⁶ 참조, 그 원리와 개발의 일반적인 검토를 위해) 몇 시간 전에 설명했지만, 필요한 컴퓨팅 파워 및 이미지 프로세싱 전문 지식은 지금까지 대부분 기기 개발에 초점을 맞춘 전문 연구 그룹에의 사용을 제....

프로토콜

1. 설정 및 데이터 수집

1. 냉동 보관 ^{(22)로부터} 구균 균주 V4051-197 KTY 매체 (부드러운 수영) 세포의 문화를 성장. 포화, 35 ° C에서 150 rpm에서 하룻밤 회전 통에 품어.
2. 포화 문화의 500 μL 신선한 KTY 매체의 10 ㎖를 접종한다. 세포가 λ = 600 nm의 (약 5 ^× 108 세포 / ml)에서 약 1.0의 광학 밀도에 도달 할 때까지 35 ° C, 150 rpm에서 추가로 3.5 시간 동안 배양한다.
3. 운동성 세포의 최종 농도를 얻기 위해 신선한 배지에서 1:400 희석.
4. 현미경 슬라이드에 높이 1 ㎜의 주위에 (예를 들어 석유 젤리로 가득 주사기부터) 그리스의 고리를 만들어 중앙에 시료 용액 한 방울을 배치합니다. 밀봉 가장자리에 가기를 눌러 가볍게 커버 유리를 놓고, 그 액체를 보장하는 슬라이드 및 커버 유리 모두와 접촉한다. 그 결과 샘플 챔버는 arou에 있어야한다깊이 차 100 ~ 200 μm의.
5. 유리와 렌즈 사이의 오일의 기포의 형성을 방지하기 위해주의 깊게 커버 유리가 아래를 향 현미경 샘플 챔버를 배치하고.
6. 샘플 챔버의 바닥면에 현미경을 집중하고, 집중 응축기를....

결과

DIHM의 기능을 설명하기 위해, 실험은 스트렙토 코커스 박테리아의 체인에서 수행 하였다. 체인 자체가 길이 10.5 mm를 측정하고, 범위 0.6-1 μm의에서 직경 6-7 sphero 원통형 셀 (체인에있는 세포의 두 가지 분열에 가까운)으로 구성되었다. 1A 및도 주요 인터페이스를 보여 1B 재건 및 렌더링 소프트웨어. 수치 집속 절차의 예는 공간적 대역 통과 필터가 적용된 경우,도 2에서 볼 수있다. 3은도 2의 이미지에 그라데이션 필터의 효과를 보여준다. 이 두 이미지 모두를 생성하는 데 사용되는 원시 데이터 프레임 (예) 108과 코드 다운로드와 함께 제공됩니다. 마지막으로,도 4는 재구성 된 형상의 좋고 나쁨 품질 데이터의 효과를 보여준다. 이 마지막 그림에서 두 프레임은 샘의 동영상에서 찍은세포의 전자 체인 (처음 두.......

토론

이 시험용 프로토콜에서 가장 중요한 단계는 안정된 실험 장치에서 이미지의 정확한 캡처이다. 가난한 배경 데이터, 높은 정확도의 재건은 불가능 옆에 있습니다. 이것이 재구성 된 이미지를 저하시킬 수로서, (대물의 뒤쪽을보고 어두운 고리로서 표시) 내부 위상차 소자와 대물 렌즈를 방지하는 것도 중요하다. 그 목적은 회절 줄무늬의 몇 쌍 (적절한 추론 defocused 표시 패턴이 포커스가있는 객체의 10 배 선형 치수를 가지고 나타나도록 자사의 이미지에서 볼 수있는 초점면에서 충분히 멀리해야한다 - 예를 들어 데이터를 볼 ). 초점면에 너무 가까이 개체는 전술 한 바와 같이, 쌍둥이 이미지와 샘플링 유물의 고통. 이 올바르게 재 집중 거리를 결정하는데 중요한 요소이기 때문에 그것은 카메라의 화소 간격의 좋은 특성이 또한 중요하다. 종종 카메라 documentat이온은 사양 '픽셀 크기'를 나열합니다,이 조금 모호 할 수 있으며, 카메라의 특정 유형 (CMOS 카메라 특히) 빛에 민감하지 않은 픽셀 사이의 공간의 중요.......

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
니콘 이클립스 Ti-E 도립 현미경	니콘 주식회사
LED	Thorlabs	M660L3	방출 파장 λ=660 nm, 선폭 약 20 nm
LED 전원 공급 장치	Thorlabs	LEDD1B
스레드 어댑터	Thorlabs	SM2T2
스레드 어댑터	Thorlabs	SM1A2
프레임 그래버 보드	EPIX	PIXCI E4
고속 CMOS 카메라	Mikrotron	MC-1362