연쇄상 구균 폐렴으로 비강 내 식민지 화 중 염증 반응의 특성화

요약

연쇄상 구균 폐렴을 이용한 뮤린 비소하린의 식민지화및 신봉또는 모집된 세포의 후속 추출이 설명된다. 이 기술은 나아레를 통해 유체의 비소하린과 수집을 플러시하는 것을 포함하며, 시투에서mRNA 발현의 차동 세포 정량화 및 분석을 포함한 다양한 판독에 적응할 수 있다.

초록

연쇄상 구균 폐렴에 의한 비인두 식민지는 폐 또는 혈류량^1에침입하는 전제 조건이다. 이 유기체는 비소하린의 점막 표면을 식민지화 할 수 있으며, 여기서 호스트 방어를 극복하고 호스트의 다른 조직에 침입할 수 있습니다. 일반적으로 낮은 호흡기에 감염의 설립은 폐렴귀착됩니다. 대안적으로, 박테리아는 높은 사망률^2와연관되는 박테혈증을 일으키는 혈류로 전파할 수 있고, 또는 그렇지 않으면 폐렴구균 수막염의 발달로 직접 이끌어 낼 수 있다. 비인두 식민지의 운동 및 면역 반응을 이해하는 것은 S. 폐렴 감염 모델의 중요한 측면입니다.

비강 내 식민지화의 마우스 모델은 인간^{모델3로부터} 적응하고 비소하린4-7의 숙주 병원체 반응 연구에서 여러 연구군에 의해 사용되어 왔다. 모델의 첫 번째 부분에서, 우리는 인간 성인의 운송 이벤트와 유사한 자기 제한 세균 성 식민지를 확립하기 위해 S. 폐렴의 임상 분리를 사용합니다. 본명 상세절차는 세균성 접종의 준비를 포함하고, 그 다음에는 행정의 비강 내 경로를 통해 접종의 전달을 통해 식민지화 사건의 수립을 포함한다. 상주 대식세포는 정상 상태 동안 비소하린의 주요 세포 유형이다. 전형적으로, 감염되지 않은 마우스에 존재하는 몇몇 림프구가^8,그러나 점막 식민지는 면역 반응 및 호스트 면역 세포의 후속 모집귀착될 낮은- 고급 염증 (세균성 종 및 긴장의 독성에 따라 다름)으로 이끌어 낼 것입니다. 이러한 세포는 나레를 통해 기관 내용물의 용암에 의해 격리될 수 있으며, 감염의 운동학을 더 잘 이해하기 위해 식민지 박테리아의 밀도와 상관관계가 있다.

프로토콜

시작하기 전에: 모든 단계는 달리 명시되지 않는 한 생물 적 위험 수준 2 (BSL2) 생물 안전 캐비닛 (BSC)에서 수행됩니다. 실험 개시 전에 기관 지침에 따라 전염성 세균 병원균의 사용에 대한 적절한 생체 위험 승인을 획득했습니다. 또한 사전에 준비된 절차를 수행하는 데 필요한 모든 재료와 시약이 있는지 확인하십시오. 이 실험에 사용된 마우스는 잭슨 연구소, 찰스 강 또는 타코닉에서 여성 C57BL/6 마우스를 포함하고 나이의 10-14 주 (비록 우리는 비강 식민지 정리 또는 감염의 운동에서 어떤 성별 의존 유의 차름을 발견하지 않았지만). 이러한 실험에 사용된 모든 마우스는 특정 병원체 없는 조건하에서 사육 및 유지되었으며, 일반적인 바이러스(LCMV, MNV, MPV, reovirus ECTV 및 기타)박테리아(예: H. 파일로리)및 기생충(예: 핀웜, 자궁내기생충)이 배설물 샘플 검사뿐만 아니라 빈번한 원자성 평가에서 빈번한 원자성 평가에 의해 사육되고 유지되었다. 이 실험을 실시할 때, 우리는 10-12 주 이하의 통제 마우스를 사용하고 나이의 6 달 이하를 사용하지 않는 것이 좋습니다. 이 나이 범위 보다는 더 젊거나 더 오래된 마우스는 더 긴 비인두 운송 기간 및 감염을 전파의 증가한 가능성에 더 영향을 받기 쉽습니다. 마우스 배경은 여러 그룹이 다른 유전 적 배경의 마우스가 S. 폐렴 D39 (혈청형 2) 균주에 다른 감수성을 가지고 있음을 입증했기 때문에 식민지 실험의 결과에 영향을 미칠 수있는 또 다른 중요한 고려 사항입니다^9,10. S. 폐렴은 자연적으로 발생하는 뮤린 병원체가 아니며 유일한 천연 저수지는 인간 비소하린입니다. 전염은 호흡기 물방울을 통해 발생하며, 마우스가 호흡기 분비를 일으키지 않기 때문에 개별 마우스는 박테리아를 다른 마우스로 전송할 수 없으므로 마우스 대 마우스^{전송(11)에}대한 우려는 없다. 이 원고에 설명된 절차에 대한 시각적 개요는 그림 1을 참조하십시오.

1. S. 폐렴 문화의 준비

1. 연쇄상 구균 폐렴의현탁액 성장을위한 트립틱 콩 통 5 ml을 접종하십시오.
2. 세균성 접종이 600nm로 설정된 주행계에 의해 결정된¹⁰⁸ CFU/ml의 해당 액체 밀도로 로그 상 성장에 도달할_때까지 37°C에서 정전기 조건하에서 배양. 이 CFU에 대응하는 정확한 판독값은 특정 선택된 세균균균에 따라 다릅니다. S. 폐렴의 대부분의 변종에 대 한이 0.45-0.55의 OD₆₀₀ 범위에 해당 합니다. 일반적으로, 액체 배양에 있는 S. 폐렴 긴장은 분과에 대한 필요없이, 권장조건하에서 1.5-2.5 시간 안에 이 조밀도로 증가할 것입니다. 배양은 박테리아가 더 이상 로그 상 성장에 있지 않고 광범위한 자동 분해를 겪고있는 지점을 나타내기 때문에 (0.75의 OD 판독을 넘어) 과잉 성장해서는 안됩니다.
3. 각 마우스는 약 10^7개의 박테리아로 접종됩니다. 따라서, 9개의 마우스마다, 에펜도르프 튜브에 접종 1ml를 하고 1분 동안 15,000 x g에서 회전한다. 희미한 펠릿을 보아야 합니다. 상체를 제거하고 펠릿을 방해하지 않도록 주의하고 인산완충식염수(PBS)의 100μl에서 박테리아를 재보페치하여 농도를¹⁰⁹ CFU/ml로 증가시킨다. 이 단계에서 박테리아는 실행 가능한 남아 있어야 하지만 쉽게 복제 하지 않습니다.
4. 여러 aliquots를 사용하는 경우 박테리아 밀도의 약간의 샘플 간 변이를 제어하기 위해 하나의 튜브로 결합하십시오.
5. 예방 접종이 준비될 때까지 박테리아를 얼음 위에 두십시오.
6. 정확한 세균 성 수를 얻으려면 깔끔한 세균 성 무접종으로 시작하여 로그 현명한 직렬 희석 시리즈를 수행하십시오. 멸균 PBS의 90 μl에 10 μl을 추가, 연속적으로 10 배 희석.
7. 희석 10 μl 샘플 10방울^{-5 -10 -9,}PBS 전용 오염 조절, 5%의 양혈액으로 보충된 트립스틱 대두 한천(TSA) 플레이트의 별도로 표지된 섹션에 플레이트아웃(그림2). 파이펫 팁이 더 높은 CFU 농도에서 낮은 CFU 농도로 희석하여 과도한 박테리아를 운반하고 결과의 가변성을 증가시키는 것을 피하기 위해 각 단계에 대해 변경되었는지 확인합니다. 인간의 혈액 통 (HBA) 플레이트는 또한 TSA 대신에 사용될 수있다. S. 폐렴의 많은 변종은 네오마이신 (5-20 μg/ml에서)에 내성이 있기 때문에, 이 항생제는 또한 플레이트 준비 단계 도중 선택의 한천 매체에 추가될 수 있습니다. 이것은 저항하지 않는 박테리아를 제거하기 때문에 열거를 용이하게합니다. 각 균주의 항생제 감수성은 각 세균성 균주에 대해 사용하는 항생제의 최적의 농도를 결정하기 위해 사전에 테스트되어야합니다.
8. 15-30분 동안 건조한 다음 플레이트를 덮고 세균 인큐베이터에 37°C 및 5% CO_2로설정하여 거꾸로 놓습니다. 24 시간 동안 접시에 세균성 식민지를 성장.
9. 식민지 형성 단위의 수와 해당 농도를 결정합니다. OD₆₀₀ 값의 결정에 기초하여, 농도는 1-4 x 10⁹ CFU/ml. S. 폐렴 식민지의 범위 내에 있어야 하며, 중앙에 작은 우울증이 있는 작은 황색 베이지색으로 나타나야 하며, 중심에 작은 우울증이 있어 도넛모양(그림3).

2. 뮤린 내트라비슬 식민지화

1. 마우스 제지 장치(팁이 잘린 50ml 팔콘 튜브)에 마우스를 고정하여 마우스를 엄지손가락으로 몸의 바닥에 고정하여 코가 테이퍼 장치의 테이퍼 끝에서 나올 수있도록(도 4). 이 장치를 사용하면 마우스의 머리를 고정하고 나레의 분리를 움직임을 최소화하고 동물의 피펫 팁을 마스티로 삼는 시도를 방해하여 접종을 완벽하게 전달할 수 있습니다. 대안적으로, 마우스는 목과 수동 구속을 스커핑하여 고정될 수 있다. 우리는 비강 내 접종 전에 동물의 마취를 권장하지 않습니다. 마취 하에 동물에게 접종을 하면 폐로 확산되는 일부 접종이^{12,13개됩니다.}
2. P10 또는 P20 파이펫을 사용하여, 준비된 문화의 10 μl을 증착하여 각 마우스를 접종하고, 두 나레스 사이에 균등하게 분배합니다(접종을 서서히 맥동시켜 코에 침을 물고, 마우스가 접종을 흡입하는 데 시간이 걸리도록 하십시오). 무분비의 완전한 전달을 달성하기 위해 마우스가 코를 과도하게 움직이기 시작하는 시점에서 일시 중지 관리. 마우스가 호기 하는 동안 코를 통해 일부를 추방 수 있습니다 전체 접종 nares에 주입 되지 않을 수 있습니다.; 그러나, 추방된 양은 극소수인 경향이 있고, 접종은 매우 많은 양의 박테리아를 함유하고 있기 때문에, 이것은 식민지 세균 부하에 크게 영향을 미치지 않습니다. 추가적으로, 비인두 점막에서 식민지화에 사용할 수 있는 표면적은 제한적이며, 결과적으로 우리 와 그 외는 권장된¹⁰⁷ 용량이 모든 마우스에서 일관된 수준의 박테리아를 얻기에 충분하다는 것을 발견하여 초기 식민지 세균의 초기 양에서 최소한의 변동성을 초래한다^14,15.
3. 최종 점 모니터링의 일환으로 중량 지표를 활용하는 경우 마우스의 무게를 측정합니다. 혼수, 주름 모피 및 체중 감소를 포함하여 임상 증상에 대한 매 12-24 시간 마다 마우스를 모니터링하십시오. 마우스는 전형적으로 3-5 일 식민지 후에 질병의 현상을 보여주지 않을 것이고, 이들은 총 체중의 약 5%를 평균할 수 있는 체중 감소에 선행될 것입니다. 마우스가 점점 아프게 됨에 따라 그들은 구부러진 자세를 가정하고 감소 된 활동과 핸들링을 포함하여 자극에 대한 반응성을 감소시다. 이 단계에서, 질병은 전형적으로 패혈증 및/또는 폐염의 표시이고 마우스가 결과를 향상하기 위하여 매일 피하 식염수의 1 ml로 취급될 수 있더라도, 말단일 것입니다. 살아남은 마우스는 하루 7 식민지 후 개선을 보여주는 시작 한다, 체중 증가 다음 체중의 안정화에 의해 입증, 비록 S. 폐렴의 다른 긴장 더 신속 하 게 질병을 유도 하 고 다른 타임 라인을 따라 임상 증상의 진행 귀착 될 수 있습니다. P1547 균주와 함께 식민지화된 마우스에서 추적된 체중의 대표적인 결과에 대해서는 도 5를 참조하십시오.

3. 비강 용암 샘플 수집

시작하기 전에: 26 3/8 G 베벨 바늘로 덮인 1ml 주사기를 사용하여 캔누울린 바늘을 준비하십시오. 2.5cm의 PE20 폴리에틸렌 튜빙을 0.38mm의 안쪽 직경으로 자르고 각 끝에 는 경작팁을 갖습니다. 집게를 사용하여 2.5cm 길이의 PE20 폴리에틸렌 튜브(내부 직경 0.38mm)를 바늘 끝에 밀어 튜브 측면을 뚫지 않도록 합니다. 캔누울린 바늘은 필요할 때까지 70% 에탄올에 보관할 수 있습니다.

1. 실험마우스를 안락사시합니다. 자궁 경부 탈구는 잠재적으로 기관을 손상시킬 수 있기 때문에, 안락사의 이 방법은 피해야 합니다. 우리의 바람직한 방법은 이소플루란 마취 다음에 흥분, 그러나, 안락사의 모드를 선택할 때 제도적 지침을 따르도록 합니다.
2. 70% 수성 에탄올을 사용하여 동물의 수퍼오엔테리어 모피, 특히 목을 살균하여 에탄올이 나레에 접근하는 것을 방지합니다.
3. 동물의 목 의 중간선을 따라 하나의 세로 컷을 하고 양쪽 끝에 두 개의 수평 컷을 만들어 기관지 구상을 위한 개방을 만듭니다.
4. 양쪽으로 피부를 조심스럽게 벗겨 내고 목 조직을 드러냅니다.
5. 기관체는 양쪽에 세로 근육에 둘러싸여, 볼 수 있어야합니다. 조심스럽게 기관 자체의 명확한 보기를 제공하기 위해 이들을 잘라, 주변 혈관을 끊지 않도록주의.
6. 혈관이 절단되고 혈액이 존재하는 경우, 진행하기 전에 출혈을 멈추고 멸균 PBS를 분배하고 멸균 거즈를 사용하여 부위를 여러 번 정화하여 부위에 여분의 수분을 부드럽게 흡수하십시오.
7. 기관체가 제대로 노출되면, 반쯤 올라가면 기관에서 횡반, 반달 컷을한다(그림 6).
8. 이전에 준비된 캔누클 바늘에 멸균 된 PBS의 1,000 μl을 그립니다.
9. 캐뉼라를 코쪽으로 기관으로 삽입하여 삽입용으로 아래쪽을 가리키는 베브 엣지를 유지합니다(그림7). 바늘이 제자리에 있으면 180 °를 회전시키고 빛 저항을 느낄 때까지 부드럽게 위쪽으로 조사하십시오.
10. 마우스코 바로 아래에 샘플 수집을 위해 지정된 Eppendorf를 배치합니다.
11. PBS 용암 유체의 최소 (~20 μl) 양을 분배하여 바늘의 올바른 배치를 테스트하십시오 - 액체 방울은 마우스의 암골 주위에 형성되어야합니다. 이 경우 3.13 단계로 진행하십시오.
12. 테스트 PBS가 동물의 입밖으로 직접 나타난다면, 캐뉼라를 뒤로 당기고, 매우 약간의 저항이 느껴질 때까지 다시 부드럽게 앞으로 재조사하여 재배치하십시오 - 비강 구개 과거를 그리고 구강을 통해 캐뉼러를 너무 멀리 밀어 내지 않도록주의하십시오.
13. 바늘의 내용을 신속하게 분배하여 최대 양의 세포를 대체하고 수집합니다 - 내용은 마우스의 나레를 통해 수집 튜브로 흘러 나가야합니다. 샘플을 얼음 위에 즉시 놓습니다.
14. RNA 분석을 위한 샘플을 수집하기 위해 동일한 마우스에 RNA 용해 버퍼 500 μl을 포함하는 캔누클 바늘을 사용하여 3.8-3.13단계를 반복한다. 이것은 비부착 세포가 초기 PBS lavage 다음 제거되어야 하기 때문에, 비인두 점막 상피로 크게 구성된 나머지 세포 집단에서 lysate 견본의 집합을 허용할 것입니다. RNA 리시스 버퍼는 상피를 비우고 주변 조직을 파괴하므로 이러한 조직의 유지가 원하는 경우 폐와 같은 장기와의 접촉을 피하기 위해주의를 기울여야합니다. 수집되면 RNA 용해 버퍼에 샘플을 드라이 아이스에 직접 배치하여 스냅 동결하십시오. 리시스 버퍼에 들어가면, 샘플은 제조업체의 지침에 따라 저장될 수 있으며 일반적으로 몇 달 동안 -70°C에서 안정적입니다.

4. 나소판스의 세균 부하 결정

1. 각 뮤린 비강 용암 샘플에 대한 직렬 희석 계열을 준비하여 박테리아를 양수합니다. 일반적으로 세균 부하는 0-10⁴ CFU 사이로 예상될 수 있으므로 3개의 10배 직렬 희석을 수행합니다. 10-1 CFU/ml의 농도에^10-1 CFU/ml. 소용돌이의 농도에 깔끔한 비강 용암 샘플 (100 CFU/ml)의 10 μl을 추가합니다.
2. 박테리아 판을 사분면으로 나누고, 희석 계열의 부재(10^0-10-3 CFU/ml)의 부재로 각각 사분면라벨을 부착합니다. 도 2에서와 같이 3 희석제의 10 μl 샘플과 트립틱 콩 한천 판의 깔끔한 샘플 3 방울을 접시에 놓습니다.
3. 15-30 분 동안 건조 한 다음 접시를 덮고 세균 성장을위한 최적의 조건 (일반적으로 37 °C 및 5 % CO_2)을사용하여 세균 인큐베이터에 거꾸로 놓습니다.
4. 18-24 시간 동안 접시에 세균 성 식민지를 성장.
5. 각 희석에 대해 플레이트에 형성된 콜로니를 평균화하여 식민지화 세균의 수를 결정한다(도3). 도 8은 비강 용암의 배양에 의해 결정된 바와 같이, 최대 21일 동안 S. 폐렴의 3가지 균주로 식민지화된 마우스에서 다른 시간대 동안 세균밀도를 나타낸다.

5. 유동 세포계에 대한 샘플 준비

시작하기 전: 항체의 혼합을 준비합니다. 백혈구 집단의 정량화를 위해, 지정된 희석제에서 다음 혼합을 권장합니다: PE-Ly6G (클론 1A8, 1 μg/ml), FITC-Ly6C (클론 AL-21,1 μg/ml), eFluor 450-CD45 (클론 30-F11, 2.67 μg/ml), APC-F4/80 (클론 PM8 RUO, 0.67 μg/ml), PerCP-Cy5.5-CD14 (C5.5-CD14 0.5 μg/ml), PE-Cy7-CD11b (클론 M1/70, 0.33 μg/ml), 알렉사 플루오르 700-CD3 (클론 1782, 4 μg/ml), eFluor 605NC-CD4 (클론 GK1.5, 6.67 μg/ml). 이 믹스는 2배 농도(5.5단계 참조)입니다. 모든 항체는 FACs 워시 버퍼(0.5% 태아 종아리 혈청, 2mM EDTA, PBS의 0.1% 나트륨 아지드)에서 희석되어야 하며, 사전에 제조해야 한다. 상류형 대조항체의 혼합물에서, 이상적으로는 표지된 항체와 동일한 공급업체로부터 특정 항체와 동일한 농도로, 제조되어야 한다. 등류형 대조군 항체로 처리된 견본은 음성 대조군으로 작동합니다. 동위원소 조절 항체로 처리된 견본에서 관찰된 임의의 형광은 배경으로 간주되어야 합니다.

1. 1.5ml 에펜도르프 튜브를 4°C로 회전할 수 있는 원심분리기를 미리 식힙니다.
2. 원심분리기 비강 용암 샘플은 4°C에서 10분 동안 2,000 x g에서 샘플링합니다. 신중하게 상체를 피펫하고 예약합니다. 참고: 비소하린스 내의 소량의 세포로 인해 원치 않는 적혈구 오염이 없는 한 세포 펠릿이 보이지 않을 것이며, 이는 밝은 빨간색입니다. 이 경우 샘플을 삭제해야 합니다.
3. Fc의 50 μl에서 샘플을 재중단? RIIb/CD16-2 (2.4G2) 항체(Fc 수용체를 결합하고 비특이적 항체 결합을 감소시키는) FACs 워시 버퍼의 농도4 μg/ml.
4. 30 분 동안 얼음에 샘플을 배양.
5. 미리 준비된 2x 농축 형광 항체 혼합물의 50 μl을 샘플에 추가합니다. 각 실험 군에서 대표 샘플을 따로 떼어 내어 등류형 대조군역할을 한다. 얼룩 혼합 대신이 샘플에 등형 항체 믹스를 추가합니다.
6. 얼음에 샘플을 1 시간 동안 배양하십시오.
7. 원심분리기 샘플은 4°C에서 10분 동안 2,000 x g에서 샘플링합니다. PBS의 200 μl에서 상체를 폐기하고 다시 중단하십시오.
8. 5.7 단계를 반복합니다.
9. 두 번째 세척 후 원심분리기는 4°C에서 10분 동안 2,000 x g로 다시 샘플을 채취한다.
10. PBS (즉시 샘플을 실행하는 경우) 또는 2 % 파라 포름 알데히드 (샘플을 실행하는 경우 1-3 일 후 염색)에서 다시 중단합니다.
11. 유동 세포측정을 수행할 때 샘플당 최대 이벤트 량을 수집하거나 전체 샘플이 흡입될 때까지 수집합니다. 감염되지 않은, 건강한, 젊은 마우스에서, 이것은 1,000-2,000 총 이벤트만큼 적게 될 것입니다; 세균성 식민지 화 이벤트 동안,이 수는 동물및 나이 및 유전 배경과 같은 요인에 있는 질병 상태에 의존하는 2-5 배 이상 증가할 수 있습니다. 도 9는 샘플 수집 전에 사용하려는 특정 유동 사이토미터에 대한 매개 변수를 최적화하는 것이 좋습니다하지만, 3 레이저 벡톤 디킨슨 LSRII 흐름 세포계에서 수집된 대표적인 유동 세포측정 결과를 보여 주며, 450의 전방 분산 및 300의 사이드 스란시를 사용하여 세포계를 최적화하는 것이 좋습니다. 참고: 샘플에 미량의 혈액 오염이 포함되어 있는 경우 수집된 총 이벤트가 예상보다 훨씬 높으며 샘플은 분석에서 할인되어야 합니다.

6. 양적 PCR (qPCR) 비강 용암 분석

1. 해동 셀은 3.14 단계 실온에서 lysates.
2. 선호하는 RNA 추출과 함께 제공되는 권장 프로토콜을 따르십시오.
3. 지시에 따라 RNA 추출 절차를 완료한 후, 분광광계 또는 전기포고계 를 사용하여 RNA의 양을 정량화한다(도10). 우리는 정기적으로 260/280 nm 비>1.7 또는 RNA 무결성 수 (RIN) 주위에, 8.1±0.13와 샘플 당 975 그리고 3,250 ng 총 RNA 사이에서 취득합니다.
4. 1,000 ng의 RNA (최대 13 μl)를 가진 제조자의 프로토콜에 따라 M-MULV 역 전사를 사용하여 cDNA를 전사한다.
5. 생성된 cDNA 샘플을 8배, 알리쿼트는 -20 또는 -80°C에서 장기 저장을 위해 4개의 개별 튜브로 동등하게 희석합니다.
6. qPCR에 의한 유전자 발현을 측정하기 위해, 얼음 또는 차가운 블록에 삼중비로 25 μl 샘플 반응을 준비: 2x qPCR 마스터 믹스의 12.5 μl qPCR 마스터 믹스 의 qPCR 키트의 qPCR 키트, 0.25 μl 참조 염료, 희석 된 cDNA의 2 μl (단계 7.5), 혼합 된 전방 및 역 프라이머의 1 μl (400 nM 최종), 9.25 μL 의 자유 Rna. 이 프로토콜은 이전에 게시된^{메서드(16)의}적응입니다.
7. 일반적으로 우리는 2 단계 qPCR 증폭 (95 °C 10 분 동안 95 °C)이 최대 40 사이클 x [95 °C x 15 초, 60 °C x 1 분]) 효과가 있음을 발견합니다(도 11a); 그러나 각 프라이머 쌍을 최적화해야 합니다. 비특이적 증폭이 발생하지 않도록 증폭 후 해리(용융) 곡선을 수행해야 합니다. 증폭(도 11b)
8. 우리는 분석된 각 유전자에 대한 표준 곡선뿐만 아니라 분석된 각 96웰 플레이트에 대한 표준 교정기(폐 또는 비장 균주에서 파생됨)를 정기적으로 실행합니다. 상대적 성적증명서 양은 먼저 기준 염료에 의해 원시 주기 임계값(Ct) 값을 정상화하고 각 표준 곡선을 통해 결과값을 변환하여 얻어진다. 이러한 상대적 양은 이후에 표준 교정기 및 가사 유전자로 정규화됩니다.

결과

그림 1은 프로토콜의 주요 단계를 요약한 개요 회로도를 나타냅니다. 도 2-3은 본 원에 기재된 프로토콜에 내재된 미생물 방법론의 시각화를 제공한다. 도 4는 내비강폐를 수행하기 위해 마우스의 적절한 위치를 나타내고, 도 5는 S. 폐렴 균주 P1547로 식민지화된 마우스의 무게의 전형적 변화를 묘사한다. 도 6-7은 이러한 두 기술의 보조 시각화를 위해 공정의 비강 용암 부분의 특정 단계를 나타낸다. 도 8-11은 비강 용암 다음 마우스의 비소하린으로부터 수집된 샘플에 대한 분석의 대표적인 결과로 구성된다. 구체적으로, 도 8은 비소하린의 세균부하의 대표적인 결과이며, S. 폐렴균제 P1121, P1547 또는 P1542로 식민지화된 마우스로부터 얻어진 비강 용암의 배양을 통해 결정된다...

토론

이 연구에서는 연쇄상 구균 폐렴의 임상 분리 균주와 박테리아에 대한 응답으로 nasopharynx에 모집 된 면역 세포의 후속 격리 및 특성화를 사용하여 마우스의 비강 내 식민지화를위한 자세한 방법을 제시했습니다. 우리는 어떻게 세균성 접종이 영양이 풍부한 매체에서 배양되고 처음에 비소하린으로 제한되는 마우스에 있는 식민지 사건을 설치하는 데 사용될 수 있는지 보여주었습니다. 그런 다음 비소하린에 모집되는 면역 세포 유형에 어떻게 반응하는지 기관 노출, 절개 및 칸침바늘을 사용하여 비강 용암을 분리할 수 있는지 를 보여주었습니다. 비강 용암 샘플은 PBS에서 수집되어 그대로 가볍게 부착된 세포를 분리할 수 있습니다. RNA는 보다 단단히 부착된 세포및 주변 상피 점막 층으로부터 RNA 용해 완충제로 구성된 이차 세척을 적용하여 분리될 수 있다. 이들 샘플의 전자는 유동 세포측정 기술을 통해 식민지화의 맥락에서 모집된 특정 세포를 표현하는 데 사용될 수 있으며, 후자는 Q-PCR 분석에 적용될 수 있으며, 이러한 ...

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
안티 마우스 Ly6C FITC	BD Pharmingen	553104
안티 마우스 Ly6G PE	BD Pharmingen
안티 마우스 CD45.1 eFluor 450	eBioscience	48-0453-82
안티 마우스 F4/80 항원 APC	eBioscience	17-4801-82
안티 마우스 CD11c PerCP-Cy5.5	eBioscience	45-0114-82
안티-마우스 CD11b PE-Cy7	eBioscience	25-0112-82
안티-마우스 CD3 Alexa Fluor 700	eBioscience	56-0032-82
안티-마우스 CD4 eFluor 605NC	eBioscience	93-0041-42
인트라메딕틱 폴리에틸렌 튜빙 - PE20	Becton Dickinson 427406
BD 1 ml 주사기	Becton Dickinson	309659
BD 26 G 3/8 피내 베벨	Becton Dickinson	305110
버퍼 RLT 용해 버퍼	Qiagen	79216
Difco Tryptic soy Agar	Becton Dickinson	236950
제세화 양 혈액	PML 미생물학	A0404
RNAqueous-Micro Kit	Ambion	AM1931
M-MuLV 역전사 효소	New England Biolabs	M0253L
GoTaq qPCR 마스터 믹스	Promega	A6001