OVO에서 융모 막 (CAM)는 신선한 육종 파생 된 종양 조직들은 단일 세포 현탁액, 영구 및 임시 찬란 설립 육종 세포주에 이식합니다. 모델은 이식편 (생존, Ki67 확산 지수, 괴사, 침투) 및 호스트 (섬유 아세포의 침윤, 혈관 안쪽으로의 성장) 행동을 연구하는 데 사용됩니다.
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이 논문에서
요약
초록
육종은 모든 새로운 치료법의 개발을 방해, 자연 이기종 매우 드문 질환이다. 육종 환자는이 질병에 대한 재현성과 낮은 비용 xenotransplant 모델을 개발하여 현재 관심을 설명하는 층화 한 후 맞춤 의학을위한 이상적인 후보입니다. 병아리 융모 막은 종 별 제한없이 이식 조직과 세포를 유지 할 수있는 자연 면역 결핍 호스트입니다. 또한, 그것은 쉽게 액세스, 조작 및 광학 및 형광 실체 현미경을 사용하여 몇 군데 있습니다. 조직학 더 이형 세포 상호 작용에 대한 자세한 분석을 할 수 있습니다.
이 프로토콜은 자세히 설명 신선한 육종 파생 된 종양 조직들은 단일 세포 현탁액, 영구 및 임시 찬란 설립 육종 세포주 (SAOS-2 SW1353)와 융모 막으로 접목 OVO에서. 병아리 생존 쥐ES는 75 %입니다. 모델은 이식편 (생존, Ki67 확산 지수, 괴사, 침투) 및 호스트 (섬유 아세포의 침윤, 혈관 안쪽으로의 성장) 행동을 연구하는 데 사용됩니다. 단일 세포 현탁액의 접목 지역화를 들어, ECM 젤 불활성 억제 물질에 비해 상당한 이점을 제공합니다. Ki67 확산 지수는 CAM의 표면에서 세포의 거리와 CAM, 치료 제품의 추가에 대한 시간 프레임을 결정하는 후자의 응용 프로그램의 지속 기간에 관련되어 있습니다.
서론
육종 치료 저항 1,2로 인해 높은 사망률을 가진 결합 조직의 드문 종양이다. 환자의 생존에 진행 그들의 낮은 연간 발생률, 자신의 폭 넓은 다양성 및 육종 세포가 체외 3,4의 문화를 열심히보고 있다는 사실에 의해 방해된다.
임상 치료 평가를위한 배양 세포의 사용은 체외에서 새로운, 분명히 활성 분자가 항상 임상 결과를 반영하지 않는 것으로 나타났습니다. 또한, 유전자 발현 배열에 의해 밝혀 게놈 변이는 항상 5-7 개별 환자에서 종양의 행동 특성에 상관하지 않습니다. 이러한 문제를 시도하고 해결하기 위해, 맞춤 의학은 이종 이식 모델에 8-12에 대한 증가 된 검색에 반영됩니다 중요성에 얻고있다.
생체 분석의는 C 사이의 복잡한 상호 작용을 반영하는 장점이 있습니다암 증식과 침윤 13에 필요한 ancer 세포와 고체 종양의 호스트 조직 환경. 현재 우리는 육종 14,15을위한 재현 이종 이식 모델로 리오 - Allantoic 막 분석 (CAM-분석)의 사용을 공부합니다. 이 분석은 널리 종양의 혈관 신생 16,1....
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프로토콜
개요 그림 1을 참조하십시오
종양 물질
1. 종양 샘플을 얻기 및 준비
환자 물질의 사용을위한 윤리위원회의 승인이 필요하며, 동의는 환자에서 얻을 수합니다.
- 개입의 시점에서 수확 대표적인 물질 (최소 1cm 3), 생검 또는 육종의 절제 하나. 생검의 적절한 위치는 동적 대비 MRI를 사용하여 정의됩니다.
- DMEM 1,000 U 페니실린 1 MG / ML 스트렙토 마이신과 보충 포함하는 멸균 병에 즉시 자료를 놓습니다.
- 실험실 - 즉시 병 (90 분 30) 수송한다.
다음의 모든 절차는 층류에서 수행됩니다.
- 멸균 페트리 접시에 유리 병의 내용물을 붓는다.
- 최대한 1m의 작은 부분에 종양 샘플을 넣어m 3 멸균 메스를 사용하여. 그들은 조직의 추가 처리를 손상하는 경향 모두 석회화 된 부분을 제거합니다.
- 무작위 CAM의 응용 프로그램을위한 10 종양 이식을.
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결과
CAM의 평가
종양 이식은 CAM (그림 2A)에 부착된다. 환자의 자료에서 단일 세포 현탁액 자주 건조, 약간 올라와 플라크 (그림 2D)를 표시합니다. CAM의 절단 후, 막의 주름 (2E와 2F 그림) 발생 표시.
상업 세포주 플라크는 세포 증식을 나타내는 시간에 더 많은 불투명됩니다. ECM 젤 다른 세포 라인은 CAM에 별개의 성장 패턴이 있습니다. GFP 신호가 강하게 남아있는 동안 SAOS2가 가능한 세포를 나타내는 접종 후 7 일에서 표면의 뚜렷한 증가, 확산 플라크를 형성한다. SAOS2 세포의 마이그레이션 CAM의 혈관 시각화 병렬 (그림 3)이 될 수 있습니다. 필터가 사용되지 않을 때 실체 현미경을 통해 관찰 할 때, 혈관을 볼 수 있습니다. 없을 때 F 종양 세포가 식별 될 수 없습니다i.......
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토론
접종 수확 시간
예방 접종의 날이 ECM 젤 (36 캠의)에 SAOS2을 사용하여 수행 및 배아 발달의 날 5와 10 사이에서 변화시켰다 타이밍.
배양 9 일 전에, CAM는 지속적으로 우리가 적용 ECM 젤을 지원하기에 충분히 큰되지 않았습니다. 수확에서 종양 세포는 때때로 깊은 CAM에서 검색 할 수 있고, 일부 ECM 젤 샘플은 알부민 또는 CAM에 느슨한 거짓말을 하였다. 일 5, 6, 그것은 병아리 기형 또는 사망의 결과로, 병아리 배아에서 종양 세포를 가하고 방지하기 힘들었다. 9 일부터 CAM 완전히 대부분의 계란 창 아래의 표면을 덮고 있었고, ECM 젤 패 수확의 순간 CAM에 부착 증명했다. 그러므로, 우리는 배아 발달의 날 9 할 접종을위한 이상적인 시간을 발견했다.
수확의 이상적인 시간의 결정에 대해, SAOS2 및 SW1353은 respectivel 후 수.......
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공개 사항
저자는 공개 아무것도 없어.
감사의 글
SW1353 연골 세포주의 세포는 친절 교수 PCW Hogendoorn와 라이덴 대학, 네덜란드의 교수 J. Bovée에 의해 제공되었다. 우리는 우리의 프로토콜의 개요의 전문적인 드로잉 J. Mestach 및 G. Wagemans 우수한 기술 지원 및 G. 드 Bruyne 감사합니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 세포주 핵세포 키트 V | Amaxa | VCA-1003 | |
| 콜라겐 분해 효소 2 용액 (500 U/ml RPMI 1640) | Sigma Aldrich | C6885 | |
| DMEM | Invitrogen | 41965-039 | |
| DMSO | Sigma | D8418 | |
| Dnase 용액 | Sigma Aldrich | DN25 | |
| G418 | Invitrogen | 11811031 | |
| Matrigel | Sigma-Aldrich | E1270 | |
| 마우스 1차 단클론 항체 Ki67 | Dako Denmark | MIB-1 | |
| 파라포름알데히드 | Fluka | D76240 | |
| PBS | Invitrogen | 20012019 | |
| PBSD | Invitrogen | 14040083 | |
| peGFP-C1 벡터 | 클론텍 | 632470 | |
| 페니실린/스트렙토마이신 | 인비트로겐 | 15140163 | |
| RPMI | 인비트로겐 | 22409-015 | |
| 트립신-EDTA 용액 | 인비트로겐 | 25300054 | |
| 바이브런트 세포 라벨링 DiI | Lifetechnologies | 22885 | |
| 백작 자동화 세포 계수기 | 인비트로겐 | C10227 | |
| 디지털 컬러 카메라 | Leica | DFC 340 FX | |
| 디지털 계란 인큐베이터 | Auto Elex Co | R-COM 50 | |
| FACS | BD Biosciences | FACSAriaIII | |
| Gentlemacs C-Tube | Miltenyi Biotech | 130-093-237 | |
| Gentlemacs Dissociator | Miltenyi Biotech | 130-093-235 | |
| Gentlemacs Dissociator 사용자 매뉴얼 h_tumor 프로토콜 | Miltenyi Biotech | ||
| [header] | |||
| 반투과성 접착 필름(Suprasorb F) | Lohmann& Rauscher | 20468 | |
| 스테레오 형광 현미경 | Leica | M205 FA | |
| Tissue-Tek 필름 자동 커버슬리퍼 | Sakura | 6400 | |
| ultraView 범용 DAB 감지 키트 | Ventana Medical Systems Inc | 760-500 | |
| Ventana 자동 슬라이드 염색기 | Ventana Medical Systems | 벤치마크 XT |
참고문헌
- Mankin, H. J., Hornicek, F. I., Rosenberg, A. E., Harmon, D. C., Gebhardt, M. C. Survival data for 648 patients with osteosarcoma treated at one institution. Clinical Orthopaedics and Related Research. 429, 286-291 (2004).
- Hoffmann, J., Schmidt-Peter, P., et al.
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재인쇄 및 허가
