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방법 논문

류신 리치의 신진 대사 라벨링 방사성 인산과 키니 아제 1과 2를 반복

9.7K 조회수

⸱

DOI:

10.3791/50523

⸱

2013년 9월 18일

 ,  , 
1Laboratory for Neurobiology and Gene Therapy, Department of Neurosciences, KU Leuven and Leuven Institute for Neuroscience and Disease (LIND)

이 논문에서

요약

류신이 풍부한 반복 키나아제 1 및 2 (LRRK1 및 LRRK2는) GTPase의 키나제 도메인을 모두 인코딩 세포에서 인산화되는 멀티 도메인 단백질입니다. 여기, 우리는 따라서 전반적인 휴대 phophorylation 수준을 측정 할 수있는 수단을 제공, 32 P 오르토와 세포 LRRK1 및 LRRK2 레이블을하는 프로토콜을 제시한다.

초록

류신 풍부 반복 키나아제 1 및 2 (LRRK1 및 LRRK2)는, 세린 - 트레오닌 키나아제 복잡한 단백질 도메인의 라스 (ROC), ROC 도메인 (COR)의 C-말단을 포함하여, 유사 도메인 조직을 나누어 paralogs 아르 류신이 풍부한 및 N-말단에 ankyrin 같이 반복. LRRK1 및 LRRK2의 정확한 세포의 역할은 LRRK2는 파킨슨 병 3,4의 병인에 관여하는 동안 그러나 LRRK1가, 1,2 신호 티로신 키나제 수용체에 연루되어, 설명 될 못하고있다. 이 보고서에서, 우리는 따라서 세포에있는이 두 단백질의 전체 인산화 수준을 측정 할 수있는 방법을 제공하고, 32 P 오르토와 셀의 LRRK1 및 LRRK2 단백질 레이블을하는 프로토콜을 제시한다. 요컨데, 궁합 LRRK 단백질이 32 P-오르토 포스페이트를 함유하는 배지에 노출 HEK293T 세포에서 발현되는 태그. 32 P-인산염은 후 세포에 의해 흡수되어 단 몇배양 시간과 인산염이 들어있는 셀의 모든 분자함으로써 방사성 표시되어 있습니다. 선호도 태그를 통해 (3xflag) LRRK 단백질은 면역에 의해 다른 세포 구성 요소에서 격리됩니다. 면역 침전물이 후, SDS-PAGE를 통해 분리, PVDF 멤브레인 및 통합 된 인산염의 분석에 도말는 말에 단백질의 오토 라디오 그래피 (32 P 신호)와 서부 검출 (단백질 신호)에 의해 수행된다. 프로토콜은 쉽게 세포에서 발현 및 면역 침전에 의해 단리 될 수있는 임의의 다른 단백질의 인산화를 모니터링하도록 구성 될 수있다.

서론

류신이 풍부한 반복 키나아제 1 및 2 (LRRK1 및 LRRK2)는 유사한 도메인 조직을 공유하는 멀티 도메인 paralogs 있습니다. 이 두 단백질은 효과적으로 ROCO 단백질 가족 5,6에 두 단백질을 분류, GTPases (복합 단백질의 라스, 또는 ROC)의 라스의 가족뿐만 아니라 ROC 도메인 (COR)의 C-말단에 가까운 GTPase의 시퀀스를 인코딩합니다. 만 LRRK2 여분 딜 domein 6-8을 인코딩하는 동안 ROC-COR 도메인 직렬의 N-말단이 두 단백질은 류신이 풍부한 반복 도메인뿐만 아니라 ankyrin 같은 도메인을 인코딩합니다. 만 LRRK2는 C-말단 부위 8 WD40 도메인을 인코딩하는 동안 ROC-COR의 C-말단, 두 단백질은 세린 트레오닌 키나제 도메인을 공유 할 수 있습니다. LRRK1 및 LRRK2의 정확한 세포의 역할은, 그러나 LRRK1 1,2 신호 티로신 키나제 수용체에 연루되어, 설명 될 아직 동안 파킨슨 병 3,4의 병인에 LRRK2의 역할에 대한 유전 적 증거를 가리 킵니다.

단백질의 인산화는 세포의 일반적인 규제 메커니즘입니다. 예를 들어, 인산화 효소의 활성화를 위해 또는 신호의 복잡한 단백질의 모집을 위해 필수적 일 수있다. LRRK2의 세포 인산화 광범위 특징으로되어 phosphosite 매핑은 ankyrin 반복과 류신이 풍부한 반복 도메인 9-11 사이의 클러스터에서 발생하는 세포의 인산화 사이트의 대부분을 보여 주었다. LRRK1 세포 인산화 사이트를 매핑 할 수 아직 가지고 있지만, COS7 세포에서 면역 침전 LRRK1 단백질의 말의 인 단백질 염색법을 사용하여 연구의 증거가 LRRK1 단백질은 셀 (12)의 인산화 것을 제안합니다.

이 논문은 32 P-인산염과 신진 대사 라벨을 사용하여 세포 라인에 LRRK1 및 LRRK2의 일반 인산화 수준을 시금위한 기본 프로토콜을 제공합니다. 전반적인 전략은 간단합니다. 궁합 LRRK의 PROTE 태그인은 32 P-오르토 포스페이트를 함유하는 배지에 노출 HEK293T 세포에서 발현된다. 32 P-인산염이 단 몇 배양 시간과 인산염이 들어있는 셀의 모든 분자 후 세포에 의해 동화함으로써 방사성 표시되어 있습니다. 선호도 태그 (3xflag는) 다음 면역에 의해 다른 세포 구성 요소의 LRRK 단백질을 분리하는 데 사용됩니다. 면역 침전물이 후, SDS-PAGE를 통해 분리, PVDF 멤브레인 및 통합 된 인산염의 분석에 도말는 말에 단백질의 오토 라디오 그래피 (32 P 신호)와 서부 검출 (단백질 신호)에 의해 수행된다.

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프로토콜

이 의정서는 LRRK2의 세포 인산화를 따라 방사성 32 P 표지 인산염을 사용합니다. 그것은 방사성 시약 모든 작업은 작업자와 환경에 방사성 방사선의 노출을 최소화하기 위해 적절한 보호 조치를 사용하여 수행되어야한다는 것을 명심하는 것이 중요합니다. 이온화 방사선을 방출하는 동위 원소를 포함하는 화합물은 기관 및 국가 수준의 컨트롤의 사용에서 인간의 건강과 엄격한 라이선스 규정에 유해 할 수 있습니다. 이 프로토콜의 실험은 Katholieke 제 대학 루벤 (KU 루뱅)에서 오픈 소스 방사선 사용 훈련을 다음과 대학의 건강, 안전 및 환경 부서에서 제공하는 좋은 실험실 연습 지침에 따라 수행 하였다. 우리의 프로토콜의 몇 가지 단계가 널리 세포 배양, SDS-PAGE, 웨스턴 블로 팅으로 배포하고 우리의 실험실에서 적용 여기에 프로토콜의 세부 사항은 제공됩니다. 그것은들해야할 것은 정확한 실험 조건은 실험실에서 실험에 따라 달라진다는 점에 유의해야 방사성 물질의 적절한 처리를 보장하기 때문에 특정 조치는 각각의 새로운 실험실 환경에 적응해야한다.

오픈 소스 방사선의 사용은 사전 규제 승인을 받아야 및 실험실 연구에서 오픈 소스 방사선을 담당하는 규제 기관은 국가에 따라 다릅니다. 사용자는 해당 절차는 현지 법률과 규정을 준수 보장하기 위해 자신의 기관 방사선 안전 책임자와상의해야합니다. 규제 기관에 대한 정보를 찾을 수 : 벨기에, 원자력 제어를위한 연방 기관에 ( http://www.fanc.fgov.be 에서 웹 사이트 프랑스어 또는 네덜란드어), 영국, 보건 및 안전 이그 제 큐 티브 ( HTTP : / / www.hse.gov.uk / 방사선 / 이온화 / index.htm으로 ), 미국 NUC에리어 규제위원회 ( http://www.nrc.gov/materials/miau/regs-guides-comm.html 캐나다), 캐나다 원자력 안전위원회 ( http://nuclearsafety.gc.ca/eng/ ), 및 독일 다스 Bundesamt FÜR Strahlenschutz에서 ( http://www.bfs.de/de/bfs ). 이 프로토콜과 관련된 안전을위한주의 사항은 본문에서 언급 된 방사성 클로버 기호 (강조 figure-protocol-1 ).

1. 세포의 신진 대사 라벨링

  1. 라벨에 대한 세포를 준비합니다.
    1. 문화 HEK293T 세포 라인의 표준 배양 조건에 따라 (37 ° C, 5 % CO 2) 8 % 소 태아 혈청 및 겐타 마이신과 DMEM에.
    2. 충분히 세포를 확장테스트 할 샘플 당 최소 1 X 10 6 세포를 얻을 수 있습니다.
    3. 세포를 Trypsinize 잘 10 6 세포 /에서 6 웰 플레이트 (35 mm 직경)로 판을 밖으로.
    4. 24 시간 세포를 도금 후, 형질 전환 또는 렌티 바이러스 벡터 매개 전달을 통해 3xflag-LRRK2 단백질을 표현한다.
      1. 형질의 경우, 추가없이 (샘플 4 μg의 DNA (pCHMWS-3xflag-LRRK2 플라스미드 13-15 또는 pCHMWS-3xflag-LRRK1 플라스미드 15)와 80 μL의 DMEM에 선형 폴리에틸렌 이민 (PEI 선형, 1 ㎎ / ㎖)의 8 μL 당 혼합 ). 15 ~ 30 분 동안 복잡한 작업을 수행 할 수있는 다음 존재하는 매체로 잘 혼합 세포 복합체를 추가합니다.
      2. 렌티 바이러스 벡터를 매개로 전달의 경우, 렌티 바이러스 벡터 인코딩 3xflag-LRRK1을 희석 또는 -2 (LV-3xflag-LRRK1, LV-3xflag-LRRK2는, 엄지 손가락의 규칙으로, 두 배의 열 변환 장치로 형질 도입, 기능 벡터 입자 즉, 수, 세포) 배양 배지에있다 lentivector의로. 상품의 설명 LV-3xflag-LRRK1 / 2의 이온 이전에 15을 설명하고있다.
    5. 세포 80-100 % 년 합류 (약 48 시간 형질 전환 또는 형질 도입 후) 경우, 인산염없이 예비 가온 (37 ° C) DMEM으로 세포를 씻어.
  2. 32 P-오르토 인산 라벨 세포.
    1. 방사선 작업시 안전의 마음 일반 원칙에 유의하십시오.
      1. figure-protocol-2 지정된 방사선 지역에 32 P와 함께 모든 작업을 수행합니다.
      2. figure-protocol-3 적절한 개인 보호 장비를 착용해야한다 - 우리의 실험실에서 표준 운영 절차에 따라 이러한 실험실 외투, 두 배 장갑, 보호 안경 (가) 있습니다.
      3. G "SRC는 ="/ files/ftp_upload/50523/50523rad1.jpg "/> 32 P와 함께 모든 작업은 노출을 최소화하기 위해 6 개 mm 방풍 스크린에 의해 사용자로부터 보호해야한다.
      4. figure-protocol-4 개인 감시 장치는 항상 사용되어야한다 - KUL 내의 모든 인증 오픈 소스 방사선 사용자가 실험을하는 동안 방사선 노출을 모니터링 할 수있는 실험실 코트의 가슴 주머니에 부착 된 필름 배지를 착용하고 있습니다.
      5. figure-protocol-5 모든 실험 표면은 가이거 카운터와 함께 사용하기 이전과 이후 방사능에 대해 평가해야한다.
      6. figure-protocol-6 모든 잠재적으로 오염 된 소모품은 RA에 대한 제도적 지침을 엄격히 준수해서 처리해야합니다dioactive 폐기물 처리.
    2. 층류에서 레이블로 세포의 6 - 웰 플레이트 당 (37 ° C에 데워진) 인산염없이 DMEM의 2.1 ㎖로 팔콘 튜브를 준비합니다.
      1. 예를 들어, 6 - 웰 플레이트의 모든 우물에 라벨 세포에, 12.6 ㎖의 배지 (= X 2.1 6)를 준비하고 있습니다. 이것은 2 ㎖ 매체 부피 5 % 과량 세포의 10 - 웰 플레이트 웰 당 사용될 위해 제공하는 것이다.
    3. figure-protocol-7 이온화 방사선 실험이 수행 될 때의 벤치를 준비합니다. 작업 공간은 흡착 물질의 보호 라이너가 배치되는에 유출 매트에 의해 덮여있다. 하나 방수 표면 라이너를 사용하는 경우, 흡수 쪽이 위로 놓습니다.
    4. figure-protocol-8 또한 제공방풍의 작업 공간에 항아리와는 인산염 배지의 튜브를 놓습니다.
    5. figure-protocol-9 냉장고의 32 중 P라는 인산염의 유리 병으로 리드 줄 지어 컨테이너를 타고 방사능 벤치에 가져다. 가이거 카운터를 사용하여 외부의 방사능 오염에 대한 컨테이​​너를 모니터링합니다.
    6. figure-protocol-10 24 μCi / ㎖의 농도로 포스페이트없이 DMEM의 튜브로 (32) P 표지 인산염을 희석.
      1. 참고 : 잘 세포의 6 - 웰 플레이트 당 2 ㎖에,이 5 μCi (32)에 배양 된 세포의 P라는 인산염 / ㎠에 해당합니다.
      2. figure-protocol-11 유지방풍 유리 항아리에 관.
    7. figure-protocol-12 32 P라는 인산염의 나머지 컨테이너를 닫고 냉장고에 교체합니다.
    8. figure-protocol-13 방사능 벤치에 보육과 장소에서 표시 할 수있는 세포를 6 - 웰 플레이트를 제거합니다.
    9. figure-protocol-14 매체 상층 액을 제거하고 폐기. 포함 된 인산염 배지 2 ㎖를 추가 32 P는 오르토 / 잘 표시.
    10. figure-protocol-15 방풍 유리 상자에 배양 플레이트를 배치 한 다음 컨테이너 FO를 모니터링가이거 카운터를 사용하여 R 외부 방사능 오염.
    11. figure-protocol-16 동위 원소 대사 라벨 전용 진핵 세포 배양기에 세포와 방풍 상자를 전송합니다.
    12. figure-protocol-17 5 % CO 2에서 37 ° C에서 1-20 시간 동안 배양한다.
      1. 일반적으로 3 시간 이상 결합 시간을 권장합니다. 원하는 최적의 배양 시간은 각각의 특정 단백질에 대한 시간 코스 실험을 통해 평가 될 수있다.
    13. figure-protocol-18 선택 사항 : 화합물과 세포를 치료.
      1. (예 키나아제 억제제와 같은) 복합 치료 실험에서, 화합물 처리 공정은 이후에 포함라벨링을 허용하도록 화합물없이 배양 시간을 itial. 원하는 배양 시간 후에, 배양 플레이트를 포함 스펙스 상자 인큐베이터에서 제거되고 방사능 벤치로 가져왔다.
      2. figure-protocol-19 레이블 매체는 화합물을 원하는 농도로 희석 된에 데워진 인산 배지 제거 및 대체됩니다. 방풍 유리 항아리에 배치 폐기물 수집을위한 50 ㎖ 튜브에 매체를 폐기하십시오.
      3. figure-protocol-20 세포는 방풍 유리 상자에 교체 원하는 접촉 시간 동안 세포 배양기에 배치됩니다.
  3. figure-protocol-21 LABE의 해물 수집주도 세포.
    1. figure-protocol-22 세포에서 매체를 제거하고 방풍 유리 항아리에 배치되는 폐기물 수집 튜브에 버린다.
    2. figure-protocol-23 세포는 방풍 유리 항아리에 배치 된 폐기물 수집 관에 세척 용액을 버리고, 차가운 얼음 TBS (트리스 50 mM의 NaCl을 150 밀리미터, 산도 7.4, 2 ㎖ / 린스)와 2 배 린스.
    3. figure-protocol-24 또한 각 얼음 냉 면역 (IP) 용해 버퍼의 0.5 ML을 추가하고 모든 용해 세포를 느슨하게하기 위해 위아래로 해물을 피펫으로 해물를 수집합니다.
      1. 프로테아제 저해제 칵테일 및 포스파타제를 추가 IP 용해 완충액 일전 (0.5 ㎖ / 시료 플러스 5 % 초과)의 필요한 양을 준비사용 직전에 신선한 억제제 칵테일.
      2. 용해 버퍼의 구성은 트리스 20 mM의 pH를 7.5, 염화나트륨 150 밀리미터, EDTA 1 ㎜, 트리톤 (Triton) 1 %, 글리세롤 10 %, 단백질 분해 효소 억제제 칵테일과 인산 가수 분해 효소 억제제 칵테일입니다.
    4. figure-protocol-25 microcentrifuge 관에 파쇄물을 전송하고 적어도 10 분 동안 얼음 위에서 배양한다.
    5. figure-protocol-26 10 분> 5,000 XG에서 마이크로 원심의 해물을 원심 분리기.
    6. figure-protocol-27 방풍의 방패 뒤에 저장되는 전용 쓰레기통에 방사성 폐기물 폐기하십시오.

2. 관심의 단백질의 레이블을 분석

  1. figure-protocol-28 immunopurification (IP)에 의해 관심의 단백질을 분리합니다.
    1. figure-protocol-29 다시 얼음을 원심 분리 해물과 마이크로 원심 튜브를 전송하고 평형 플래그-M2 아가로 오스 비즈 10 μL 침대 볼륨을 포함하는 microcentrifuge 관에 뜨는을 피펫.
      1. 미리 평형 플래그-M2 아가로 오스 비즈 튜브를 준비합니다.
      2. 이를 위해, 10 ㎕의 샘플 당 베드 부피 플러스 5 % 초과에 대응 플래그 M2-아가 로스 슬러리의 부피 피펫.
        1. 일반적으로, 구슬의 10 μL 침대의 볼륨은 20 ㎕의 슬러리에 해당합니다. 자세한 내용은 제품 데이터 시트를 참조하십시오.
      3. IP 용해 버퍼의 10 권 (침대의 볼륨을 기준으로)의 3 배를 세척하여 구슬을 평형.
      4. 샘플 수만큼의 튜브에 10 ㎕의 침대 볼륨 / 튜브 균일 평형 구슬을 배포합니다. 각 샘플에 대한 식별자와 튜브를 라벨.
    2. figure-protocol-30 방사성 클로버 표시가있는 50 ㎖ 튜브 (약 6 마이크로 원심 tubes/50의 ML 튜브)에 마이크로 원심 튜브를 전송하고 얼음에 보관.
    3. figure-protocol-31 1-20 시간 동안 4 ° C에서 혼합 말에 말에 대한 차가운 실내를 지정된 영역에 방풍 방패 뒤에 회전 장치로 전송 샘플.
    4. figure-protocol-32 얼음에 지정된 작업 공간에 샘플을 전송합니다.
    5. 50523rad1highres.jpg "SRC ="/ files/ftp_upload/50523/50523rad1.jpg "/> 마이크로 원심 (1,000 XG, 1 분)에 플래그-M2 아가로 오스 비즈를 결합 단백질을 스핀 다운 및 폐기물 수집 튜브에 뜨는 폐기하십시오.
    6. figure-protocol-33 1 ㎖ IP 세척 버퍼에 재현 탁하여 단백질 결합 플래그-M2 아가로 오스 비즈를 씻으십시오.
      1. IP 세척 버퍼의 구성 : 트리스 25 mM의 pH를 7.5, 염화나트륨 400 밀리미터, 트리톤 1 %. 또한 공동 정화 단백질 분해 효소에 의해 또는 공동 정화 인산 가수 분해 효소에 의해 탈 인산화에 분해에 민감한 단백질 세척 버퍼에서 단백질 분해 효소와 인산 가수 분해 효소 억제제를 포함하는 것이 좋습니다.
      2. figure-protocol-34 마이크로 원심에있는 단백질 결합 플래그-M2 아가로 오스 비즈 (1,000 XG, 1 분) 스핀 다운 및 폐기물 컬렉터 엔진에 뜨는 폐기기 관.
      3. figure-protocol-35 세척 단계의 3 배를 반복합니다.
    7. figure-protocol-36 세척 한 후, 1 ㎖ IP 린스 버퍼 (트리스 25 mM의 pH를 7.5, MgCl2를 10 밀리미터, 디티 오 트레이 톨 (DTT) 2 ㎜, 트리톤 0.02 %, 베타 - 글리세로 5 mm의 나 3 VO 4 0.1 ㎜)에 구슬을 재현 탁.
    8. figure-protocol-37 마이크로 원심에있는 단백질 바인딩 플래그-M2 아가로 오스 비즈 (1,000 XG, 1 분) 스핀 다운 및 폐기물 수집 튜브에 뜨는 폐기하십시오. 모든 여분의 버퍼를 제거합니다.
    9. figure-protocol-38 40 & M에 재현 탁 비즈U, IP 샘플 SDS 로딩 버퍼의 L (트리스 - 염산 160 mM의 pH를 6.8, SDS 2 %, DTT 0.2 M, 글리세롤 40 %, 브로 모 페놀 블루 2 ㎎ / ㎖).
      1. 샘플은 즉시 분석하거나 불순한 분석을 위해 -20 ° C 냉동고에 저장 될 수 있습니다.
        1. figure-protocol-39 방사성 시료의 저장을 위해 최선을 다하고 방사성 클로버 기호 표시 냉동고에서 방풍 유리 상자의 튜브 용기 나 상자에 -20 ° C, 장소 샘플에서 샘플을 저장하십시오.
    10. figure-protocol-40 방풍의 방패 뒤에 저장되는 전용 쓰레기통에 방사성 폐기물 폐기하십시오.
  2. figure-protocol-41 SDS-PAGE 및 BLO를 통해 IP 샘플을 해결PVDF 막에 t.
    1. figure-protocol-42 비드 펠렛> 1,000 XG에 1 분 2 분 원심 분리기 95 ° C의 로딩 버퍼에 열 샘플.
    2. figure-protocol-43 방풍 화면 뒤에 방사능 벤치에 단백질 겔 전기 영동 모듈을 준비합니다.
    3. figure-protocol-44 3~8% 트리스 - 아세테이트 SDS-PAGE 젤 상에로드 샘플.
      1. 겔이 유형의 고 분자량 (HMW) 단백질 분해에 적합하다. 다른 젤 타입은 또한 4-20% 비스 - 트리 신 젤 또는 트리스 - 글리신 4~20% 젤로, 적합 할 수있다.
      2. HMW 단백질의 크기를 분별하기에 적합한 분자량 마커를 포함합니다.
      4. <리> figure-protocol-45 1 시간 동안 150 V에서 전기 영동을 수행합니다.
    4. figure-protocol-46 전기 영동 후에는 플라스틱 케이스에서 젤을 제거하고 웨스턴 블로 팅 전송 버퍼와 컨테이너에 젤을 전송합니다.
      1. 웨스턴 블로 팅 전송 버퍼의 구성 : 트리스 50 밀리미터, 글리신 40 ㎜, SDS 0.04 %, 메탄올 20 %.
      2. figure-protocol-47 같은 잘 구분하고 튀어 젤의 바닥 부분으로 돌출 젤의 부분을 잘라.
    5. 1 분 동안 메탄올에 침지시킴으로써 젤 당 하나의 폴리 불화 비닐 리덴을 준비 (PVDF) 막, 다음 전송 버퍼에 배치.
      1. 세포막의에​​ 절단 젤 + 3 mm의 여유로 AME 크기.
    6. 방사능 벤치에 반 건조 블로 팅 모듈을 배치하고 커버와 상부 전극 판을 제거합니다.
    7. figure-protocol-48 세미 드라이 블롯 모듈의 표면에 블로 팅 샌드위치를​​ 준비한다.
      1. 블로 팅 모듈의 바닥 판에 전송 버퍼와 장소에 필터를 모래 바닥 (7.5 X 10cm 대형, 두께 2.5 mm) 여분의 두께를 적 십니다.
      2. figure-protocol-49 블로 팅 필터의 사전 젖은 PVDF 멤브레인을 놓습니다.
      3. figure-protocol-50 조심스럽게 PVDF 막에 젤을 배치하고 공기 방울을 제거합니다.
      4. 523/50523rad1highres.jpg "SRC ="/ files/ftp_upload/50523/50523rad1.jpg "/>는 모래 바닥 모듈의 바닥 판에 전송 버퍼와 장소에 여분의 두꺼운 블로 팅 필터를 적시에 오점 샌드위치를​​ 완료합니다. 모든 공기를 제거 모래 바닥 샌드위치 결국 현재의 거품.
        여기에 주어진 설명은 전극이 단백질 막에 아​​래로 마이그레이션하도록하는 바이오 래드 트랜스 오 SD 시스템과 호환되어 있습니다. 기타 블로 팅 시스템은 또한 그러한 결국 고려 다른 블로 팅의 방향을 취할 필요하거나, 탱크 블롯, 상기 전기 영동 완충액과 동일한 방법으로 폐기되어야하는 여분의 액체 폐기물의 경우에서와 같이 작은 적응와 이러한 단계와 호환된다.
    8. figure-protocol-51 흡수성 티슈로 모든 초과 버퍼를 제거하고 상부 플레이트와 반 D의 커버를 배치 공예 모듈을 모래 바닥.
    9. figure-protocol-52 1 ~ 2 시간 동안 15 V에서 단백질을 전송합니다.
    10. figure-protocol-53 이 시간 동안 전기 영동 모듈을 정리.
      1. figure-protocol-54 방풍의 방패 뒤에 저장되는 전용 쓰레기통에 방사성 폐기물 폐기하십시오.
      2. figure-protocol-55 증류수 (AD)와 전기 모듈을 씻어 방사성 액체 폐기물 용기에 헹굼 물을 폐기하십시오.
    11. 0523/50523rad1.jpg "/> 전송 한 후, 블로 팅 모듈에서 제습 단백질과 PVDF 멤브레인을 제거합니다.
    12. figure-protocol-56 선택 사항 : 단백질을 시각화하는 도말 단백질의 개양귀비 빛의 S 염색을 수행합니다.
      1. figure-protocol-57 개양귀비 빛의 S 솔루션을 포함하는 얕은 오 배양 용기에 오점을 전송하고 5 분 동안 품어.
      2. figure-protocol-58 AD에 신속하게 배를 씻어.
    13. figure-protocol-59 막 건조.
  3. / files/ftp_upload/50523/50523rad1.jpg은 "/> 오토 라디오 그래피를 수행합니다.
    1. figure-protocol-60 1~5일의 인광 판에 막을 노출.
    2. figure-protocol-61 동등한 스톰 840 인광 스캐너를 사용하여 노출 된 인광 판의 오프 32P를 읽고 고해상도 TIFF로 이미지를 저장합니다.
  4. figure-protocol-62 면역 통해 단백질 수준을 검출한다.
    1. figure-protocol-63 메탄올로 간략하게 찍기로 막을 재수, 다음 PBS와 얕은 오 배양 용기에 전송할 수 있습니다.
    2. figure-protocol-64 5 %의 우유가 포함 된 (0.1 % 트리톤 (Triton)과 PBS) PBS-T의 세포막을 차단합니다.
    3. figure-protocol-65 적절한 세척 단계와 차 항체 배양 안티 플래그 항체 및 프로세스 더 안티 LRRK2 항체 13, 16 이상을 말을 품다.
    4. figure-protocol-66 LRRK2의 상대적 단백질 수준을 확인하기 위해 화학 발광 검출을 수행합니다.
  5. LRRK2 32 P의 결합을 정량화.
    1. 같은 ImageJ에 소프트웨어, 국립 Instit에서 사용할 수있는 프리웨어 프로그램으로 해당 소프트웨어를 사용하여 오 autoradiograms 및 면역 반응에 밴드의 농도계 분석을 수행건강 웹 사이트의 백인 군대 ( http://rsbweb.nih.gov/ij/ ).
    2. 면역 수준에 방사 법적 신호의 비율로 인산 결합의 수준을 계산합니다.

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결과

세포에서 LRRK1 및 LRRK2의 전체 인산화 수준을 비교하기 위해, 3xflag는 LRRK1 태그와 LRRK2는 HEK293T 세포 (15)로 표현했다. 세포는 6 - 웰 플레이트에서 배양 32 P로 표지 및 프로토콜 텍스트에서 설명한 바와 같이 분석했다. 그림 1은 HEK293T 세포에서 LRRK1 및 LRRK2의 신진 대사 라벨링에 대한 대표적인 결과를 보여줍니다. 방사성 인산 결합이 LRRK1 및 LRRK2 모두 관찰된다. 통계적 의미가 있지만 반대로 플래그 항체와 면역의 농도계 분석에 의해 측정 된 단백질의 수준으로 정상화 32 P 수준의 정량화에, 그것은 LRRK1 테스트 조건에서 LRRK2보다 낮은 평균 인산화 수준을 한 것으로 나타났습니다 (P> 0.05)에 도달하지.

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그림 1. LR...

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토론

이 논문은 32 P-인산염과 신진 대사 라벨을 사용하여 세포 라인에 LRRK1 및 LRRK2의 일반 인산화 수준을 시금위한 기본 프로토콜을 제공합니다. 전반적인 전략은 간단합니다. 궁합 LRRK 단백질이 32 P-오르토 포스페이트를 함유하는 배지에 노출 HEK293T 세포에서 발현되는 태그. 32 P-인산염이 단 몇 배양 시간과 인산염이 들어있는 셀의 모든 분자 후 세포에 의해 동화함으로써 방사성 표시되어 있습니다. 선호도 태그 (3xflag는) 다음 면역에 의해 다른 세포 구성 요소의 LRRK 단백질을 분리하는 데 사용됩니다. 면역 침전물이 후, SDS-PAGE를 통해 분리, PVDF 멤브레인 및 통합 된 인산염의 분석에 도말는 말에 단백질의 오토 라디오 그래피 (32 P 신호)와 웨스턴 검출 (단백질 신호)에 의해 수행된다. 이 프로토콜은 LRRK2의 AU를 측정하는 프로토콜과 구별 될그 LRRK1의 라벨 또는 LRRK2의 tophosphoryl...

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공개 사항

저자가 공개하는 게 없다.

감사의 글

우리는 또한이 연구를 지원하는 마이클 J. 폭스 재단에 감사하고 있습니다. 플랑드르 FWO (FWO 프로젝트 G.0666.09, JMT에 선임 연구원의 교제), IWT SBO/80020 프로젝트 신경 TARGET, KU 루뱅 (OT/08/052A 및 IOF-KP/07 / 001) - 우리는 연구 재단 감사 자신의 지원. 이 연구는 또한 JMT은 킹 보두앵 재단에 의해 관리되는 기금 Druwé-Eerdekens에 의해 부분적으로 지원되었다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
인-32 방사성 핵종, 1 mCi, 1 ml 물에 디소듐포스페이트 완충액Perkin ElmerNEX011001MC
Dulbecco’ s Modified Eagle Medium (D-MEM) (1X), 액체 (고포도당)Invitrogen11971-025이 매체에는 인산염이 포함되어 있지 않습니다.
Anti Flag M2 친화력 젤SigmaA2220빨간색 젤이 있는 동등한 제품(구슬을 더 쉽게 시각화하는 데 유용)에는 cat을 사용하십시오. 번호 F2426.
매우 두꺼운 블로팅 필터Bio-Rad1703965
Ponceau S 솔루션SigmaP7170

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